[发明专利]生产β-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1. 一种生产β-熊果苷的工程菌，其特征在于：包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、邻氨基苯甲酸 5-羟化酶、龙胆酸脱羧酶和葡糖基转移酶的基因。

2.根据权利要求1所述的生产β-熊果苷的工程菌，其特征在于：还包括在所述宿主内同时敲除了编码pykA和pykF的基因。

3.根据权利要求1或2所述的生产β-熊果苷的工程菌，其特征在于：还包括在所述宿主内过表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶的基因。

4.根据权利要求1或2所述的生产β-熊果苷的工程菌，其特征在于：进一步包括在所述宿主内过表达编码葡萄糖磷酸变位酶和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的基因。

5.一种权利要求1所述的生产β-熊果苷的工程菌的构建方法，包括步骤：

重组表达质粒 将编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、邻氨基苯甲酸5-羟化酶、龙胆酸脱羧酶和葡糖基转移酶的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；

构建工程菌 将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到生产β-熊果苷的工程菌。

6.根据权利要求5所述的生产β-熊果苷的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用Red重组的方法敲除pykA和pykF基因，获得敲除pykA和pykF基因的工程菌株。

7.根据权利要求6所述的生产β-熊果苷的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用中拷贝质粒共表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶的基因。

8.根据权利要求5或6或7所述的生产β-熊果苷的工程菌的构建方法，其特征在于：还包括采用低拷贝质粒共表达编码葡萄糖磷酸变位酶基因和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶基因的基因。

9.一种生产β-熊果苷的工程菌的应用，其特征在于：按照体积比1%～5%的接种量，将权利要求1～4任一项所述的生产β-熊果苷的工程菌接种到培养基中，并加入诱导剂，在28℃～40℃进行发酵处理，制得β-熊果苷；所述培养基中的碳源为葡萄糖、甘油或两者的组合。

10.根据权利要求9所述的生产β-熊果苷的工程菌的应用，其特征在于：所述培养基包括1～5 g∙L‾¹ MOPS，5～40 g∙L‾¹葡萄糖，5～40 g∙L‾¹甘油，1～5 g∙L‾¹酵母粉，5～8g∙L‾¹ NaHPO₄，0.3～2 g∙L‾¹ NaCl，3 g∙L‾¹ KH₂PO₄，1～5 g∙L‾¹ NH₄Cl，240～250 mg∙L‾¹ MgSO₄，14～15.5 mg∙L‾¹ CaCl₂。