[发明专利]生产β-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种生产β‑熊果苷的工程菌，包括在宿主内共表达编码异分支酸合成酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、邻氨基苯甲酸5‑羟化酶、龙胆酸脱羧酶和葡糖基转移酶的基因。上述工程菌还包括在所述宿主内过表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶、3‑脱氧‑7‑磷酸庚酸合酶、葡萄糖磷酸变位酶和UTP‑葡萄糖‑1‑磷酸尿苷酰基转移酶的基因来实现β‑熊果苷的增产。本发明还提供一种上述生产β‑熊果苷的工程菌的构建方法和应用。利用上述生产β‑熊果苷的工程菌，以葡萄糖和/或甘油等碳源来生产β‑熊果苷，实现了β‑熊果苷的从头合成。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产β-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

熊果苷又名熊果素，呈白色针状结晶或粉末。萃取自熊果的叶子，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。它是当今流行的最为安全有效的美白原料，主要用于高级化妆品的制备，可配制成护肤霜、祛斑霜、高级珍珠膏等，既能美容护肤，又能消炎、抗刺激性。同时还可制成新型烫伤膏，特点是快速止痛，消炎力强，迅速消除红肿，愈合快，不留疤痕。目前熊果苷在欧美及亚洲国家应用极为广泛，目前知名化妆品如资生堂、高丝、雪肌精等均有熊果苷系列产品。

熊果苷存在两种构型，分别为α-熊果苷和β-熊果苷。目前市场销售的均为β-熊果苷，以对羟基苯酚为前体，经过化学合成生产。其中，β-熊果苷的英文名称：β-Arbutin，英文别名：hydroquinone O-β-D-glucopyranoside；CAS号：497-76-7，分子式是C₁₂H₁₆O₇，结构式：，分子量：272.25。β-熊果苷的市场售价约500元/千克，市场容量为200吨，市场价值约为1亿元人民币。β-熊果苷多为化学方法合成，少有记载利用纯生物过程制备的。

发明内容

有鉴于此，本发明确有必要提供一种生产β-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。

所以，本发明的第一个目的是从大量生物或微生物体内能够合成β-熊果苷的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现β-熊果苷的异源合成。为此，本发明优选了来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的酶的相关基因，通过这些酶的表达，利用简单碳源实现了β-熊果苷的生物合成。

本发明的第二个目的在于提供高产β-熊果苷的宿主，通过向原始或改造过的细菌、真菌、酵母中导入一条高效生产β-熊果苷的途径来生物合成β-熊果苷。

本发明的第三个目的在于通过抑制竞争途径、模块优化等一系列代谢调控方式来提高β-熊果苷的产量。实验结果表明，在正常条件下，代谢工程改造菌利用葡萄糖、甘油等简单碳源来生产β-熊果苷，能达到54.7±10 mg/L的产量，而在经过优化后，利用简单碳源的代谢工程菌能达到6.03±0.02 g/L的最终产量。

本发明涉及异源生物合成β-熊果苷的代谢途径，通过增强上游分支酸合成途径酶的表达，优选来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的外源酶，选用原始或改造过的细菌、酵母、真菌作为宿主细胞，成功实现了β-熊果苷的生产。

为了实现上述目的，本发明提供一种生产β-熊果苷的工程菌，包括：在宿主内共表达编码异分支酸合成酶（EntC）、异分支酸丙酮酸裂解酶（PchB）、邻氨基苯甲酸 5-羟化酶（SalABCD）、龙胆酸脱羧酶（GD）和葡糖基转移酶（AS）的基因。

其中，所述宿主为细菌、酵母或真菌，其中，所述细菌或真菌为原始的或改造过的。优选地，所述宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母或黑曲霉。

基于上述生产β-熊果苷的工程菌，还包括在所述宿主内同时敲除了编码pykA和pykF的基因。