[发明专利]一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺

说明书

本发明涉及一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，该工艺通过三七黑斑病病原菌为指示菌，筛选出可高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌——金色产色链霉菌，进一步优化培养基组分，添加无机盐对金色产色链霉菌的代谢网络进行扰动，强化目标产物生成途径，促进了产物的生成。同时对多抗霉素发酵工艺进行优化，采用定量补加饴糖，自动控制pH值滴加浓氨水的方法进行补料分批发酵方法，大幅提高了发酵单位及生产产量，降低生产成本。

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺。

背景技术

多抗霉素（Polyoxin）又名多抗菌素、多氧霉素、多效霉素，是一种用现代生物工程技术生产的肽嘧啶核苷类广谱农用抗生素。多抗霉素具有内吸性和治疗作用及高度的靶标生物选择性，其可专一地作用于多种作物的常见真菌性病害。多抗霉素最突出的是对鞭毛菌、子囊菌、半知菌类等二十五种真菌性病害均有较强的抑制作用。国内外大量田间试验结果表明，多抗霉素对瓜、果、蔬菜的灰霉病、立枯病、白粉病、炭疽病、茎枯病、枯萎病、黑斑病等多种病害防治优良，对水稻纹枯病，大（小）麦白粉病等作物病害也明显效果。对三七黑斑病、草毒灰霉病、苹果斑点落叶病、梨黑斑病、烟草赤星病的防效尤其显著，是这些病害防治的首选杀菌剂。多抗霉素的生物学活性是重要特性，其专门作用于植物病原菌，对人、畜安全，对皮肤和眼睛无刺激性，无药害，不杀伤天敌昆虫，无积累作用，无“三致作用”，安全性极高。多抗霉素还具有添加微量能促进作物生长和防御能力，一般平均增产15-25%。多抗霉素与自然的适应性及相容性较好，施用后降解很快，无残留、不污染环境，不存在交叉耐药性及稳定性强等诸多优点，已成为国内生物农药的一线药物之一。

纵观国内外发展，可以发现，人们虽然对多抗霉素的发酵生产进行了诸多研究，但仍存在原始菌株产多抗霉素能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题。目前，国内报道的发酵法生产多抗霉素产量约为2500µ/ml左右，但发酵时间均在150h左右，且反应体系中多抗霉素类似物等副产物较多，糖的利用率和产物浓度都有待进一步提高。多抗霉素高密度培养方法的研究与开发成为提高目标产物产量、降低生产成本，打破国际市场垄断的关键。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，其通过筛选出高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌金色产色链霉菌，并对其进行培养、发酵和补料分批发酵来提高多抗霉素的生物量，进一步提高多抗霉素产生菌对多抗霉素的发酵水平，提高发酵单位和产量，以降低多抗霉素的生产成本，为生物农药的大规模生产和应用推广提供了一个有效的途径。

更为具体的，本发明采用如下技术方案：一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，包括如下步骤：

（1）金色产色链霉菌选育：以三七黑斑病病原菌为指示菌，利用抑菌圈法筛选出金色产色链霉菌；

（2）金色产色链霉菌的培养：将步骤（1）中筛选出的金色产色链霉菌菌株接种于培养基进行培养后，26-28℃培养8-10d后，选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在200±10rpm，26-28℃培养32-36h；

（3）发酵工艺：移取体积比为10-15:100种子液培养基与发酵培养基，接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积装液量为60-70%，控制罐压为0.03-0.05Mpa、发酵温度为26-28℃、通气比为1:0.5-0.6、搅拌转速为120-150rpm，发酵时间为30-40h；

（4）补料分批发酵工艺：在发酵过程中，还原糖浓度保持在1.0-2.0%，pH值控制在6.0-6.5，发酵培养120-140h，得到发酵液。

在本发明的优选的实施方式中，步骤（1）中，所述的抑菌圈法为利用具盖玻璃大盘30cm×30cm的双层培养基抑菌圈法。本发明所筛选出金色产色链霉菌为能够高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌。