[发明专利]一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法在审
| 申请号： | 201910972360.0 | 申请日： | 2019-10-13 |
| 公开（公告）号： | CN110734958A | 公开（公告）日： | 2020-01-31 |
| 发明（设计）人： | 鞠巍;徐根明;潘艺;赵谦 | 申请（专利权）人： | 湖南大地同年生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06 |
| 代理公司： | 43237 长沙睿翔专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 周松华;孙建霞 |
| 地址： | 410205 湖南省长沙市长沙*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 扩增 捕获 测序文库 免疫组库 高通量 构建 轻链 特异性引物 医学检测 单分子 低丰度 偏好 人源 重链 标签 分析 | ||
1.一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，先后加入RT1引物、单分子标签进行逆转录和模板转换反应，得到带单分子标签的cDNA；
(3)以一链合成物为模板，加入TS-index引物和RT2引物，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域，并添加测序接头，得到带单分子标签的DNA；
(4)将特异性扩增产物分选纯化后，加入P7接头引物、P5接头引物，进行PCR扩增，得到测序文库。
2.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的单分子标签的序列如SQE ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述单分子标签的3’末端还连接有多个简并碱基，所述简并碱基的个数为1-20个。
4.根据权利要求3所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述简并碱基为原始碱基和/或修饰碱基，所述修饰碱基包括硫代修饰、甲基化修饰、LNA修饰和/或次黄嘌呤修饰。
5.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RT1引物包括如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、和/或SEQ ID NO.10所示的序列。
6.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述RT2引物包括如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.17所示的序列。
7.根据权利要求6所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述RT2引物的3’末端还连接有原始碱基或修饰碱基，其中，所述修饰碱基包括硫代修饰、甲基化修饰、LNA修饰和/或次黄嘌呤修饰。
8.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述TS-index引物的序列如SEQ ID NO.18所示。
9.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(4)中，P7接头引物的序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.18所示，P5接头引物的序列如SEQ ID NO.20所示。
10.根据权利要求1-9任一项所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逆转录反应的反应温度为25-50℃，反应时间为30-90min。
11.根据权利要求1-9任一项所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述样本包括人源TCRα、TCRβ、BCR重链H、BCR轻链L、BCR轻链K的CDR区域。
12.根据权利要求1所述的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，其特征在于，所述方法适用的技术平台为第二代测序平台。
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