[发明专利]一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法

说明书

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法。本发明利用类似5’RACE的SMART技术和特异性引物，可特异性捕获并无偏好扩增人源RNA中所有低丰度TCRα、TCRβ、BCR重链H、BCR轻链L、BCR轻链K的整个CDR区域(可以单独捕获扩增其中一项，也可以同时捕获扩增所有项目)，并采取一种简单高效的方式对其进行高通量测序文库的构建，从而进行TCR和BCR免疫组库分析。

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法。

背景技术

免疫组库是指在任意指定时间点、个体内所有特异性不同的T淋巴细胞和B淋巴细胞克隆的总和。免疫组库测序是运用高通量测序技术来研究TCR或BCR编码基因多样性的一项技术，通过该技术可以反应T/B细胞克隆变化与疾病的关系，此方法目前在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及移植等多个领域得到广泛应用。

DNA和RNA均可成为免疫组库的研究对象。但是，以DNA作为免疫组库测序模板有以下缺点：①扩增过程使用大量的引物对，但是引物之间不可能完美地匹配扩增，易产生非真实性的重组序列；②J-C区之间存在大量内含子使其下游引物必须位于J区；③引物设计来自已知的参考序列，无法捕获未知的序列。使用RNA作为模板建库，下游引物可以选自C区，具有高度的敏感性，而且使用一对引物即可从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’末端，可最大限度避免PCR扩增偏好性，并且可以捕获未知的转录本。但是其也具有不可忽视的缺陷，例如，采用RACE方法进行建库，其生成的文库只包含可变区的一部分，只能对免疫组库的TCR或BCR，或部分亚型进行建库，并不能称为真正的免疫组库。

中国专利201410442470.3以全血mRNA为模板，基于5’RACE方法进行建库，但是只能单一检测TCR-β免疫组库，并不能检测TCR-α和BCR免疫组库，并且在PCR过程中会引入错配。

中国专利201510488029.3以cfDNA为模板，采用多重PCR扩增技术，能够实现BCR H链和TCRβ链的免疫组库检测，但是一方面由于多重PCR本身的技术缺点，会偏好性地扩增某个区域，会存在非特异性扩增，另一方面此专利并没有对TCR-α和BCR的轻链进行检测，不能说是完整的免疫组库。

除此之外，还有利用5’RACE或类似5’RACE方法进行建库的方法，但多是利用dTPrimer进行RT，然后进行两次PCR，最后再连接测序接头进行建库。这些方法，只能利用具有Poly A尾的RNA进行RT，对低丰度的转录本有局限性。

发明内容

本发明的目的是提供单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法。

根据本发明具体实施方式的单分子标签免疫组库高通量测序文库构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，先后加入RT1引物、单分子标签进行逆转录和模板转换反应，得到带单分子标签的cDNA；

(3)以一链合成物为模板，加入TS-index引物和RT2引物，进行半巢式扩增，特异性扩增目标区域，并添加测序接头，得到带单分子标签的DNA；

(4)将特异性扩增产物分选纯化后，加入P7接头引物、P5接头引物，进行PCR扩增，得到测序文库。

优选地，所述步骤(2)中，所述的单分子标签的序列如SQE ID NO.1所示。

优选地，步骤(2)中，所述单分子标签的3’末端还连接有多个简并碱基，所述简并碱基的个数为1-20个。

优选地，所述简并碱基为原始碱基和/或修饰碱基，所述修饰碱基包括硫代修饰、甲基化修饰、LNA修饰和/或次黄嘌呤修饰。