[发明专利]一种受体拮抗剂长效性分析方法

权利要求书

1.一种受体拮抗剂长效性分析方法，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，其受体拮抗剂长效性分析方法包括以下步骤：

1）基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；

2）对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；

3）利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；

4）根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。

2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1）中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1）中已知的激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。

4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤2）中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：

[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0 ~ 4.5 × 104个/孔，细胞培养液体积为40 µL/孔，接种后细胞培养时间为18 ~ 24 h；

[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的卡巴胆碱激动剂以浓度为0.1 ~ 10000 nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

[3]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为0.01 ~ 100000 nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

[4]再向已加入了噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱；

[5]获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的，并计算每个拮抗剂的IC80值或者IC50值。

5.根据权利要求4所述的方法，所述拮抗剂的拮抗活性的检测步骤[2]、步骤[3]、步骤[4]中检测DMR特征信号谱使用的检测平台为康宁第三代Epic®成像仪，步骤[2]和步骤[3]检测的信号是细胞动态质量重置引起的波长位移，步骤[4]检测的信号是药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。

6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤3）中拮抗剂的长效性分析步骤如下：

[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0 ~ 4.5 × 104个/孔，细胞培养液体积为40 µL/孔，接种后细胞培养时间为18 ~ 24 h；

[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为IC80值或者IC50值加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；

[3]拮抗剂与受体作用1 h后在不同时间段洗净拮抗剂溶液，重新加入40 µL HBSS缓冲盐；

[4]向[3]加入了新的HBSS缓冲盐的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测拮抗DMR特征信号谱；

[5]获得的所有DMR特征信号谱为每个拮抗剂在解离不同时间里剩余的拮抗作用。

7.根据权利要求1所述的方法，所述步骤4）中判断该拮抗剂的长效性的判断依据是在解离不同时间里每个拮抗剂的拮抗作用。