[发明专利]一种受体拮抗剂长效性分析方法

说明书

本发明公开了一种受体拮抗剂长效性分析方法，属于受体拮抗剂长效性分析方法领域。之前受体拮抗剂长效性评价主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，无需放射性标记，降低试验难度，有效的缩短试验周期，提高试验效率。本发明中的方法评价的化合物噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与放射性标记方法的结论一致。本发明提到的受体拮抗剂长效性分析新方法具有检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等优点。

技术领域

本发明涉及长效性分析方法技术领域，具体涉及一种受体拮抗剂长效性分析方法领域。

背景技术

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族。目前确定的M 受体有5种亚型，即M1～M5，其中M1、M2和M3受体存在于人类肺脏，与COPD的发生发展密切相关。其中M3主要表达于气道平滑肌细胞、黏膜下腺体、肺血管中。M3在肺部呼吸道平滑肌的量虽然很少，但M3可联合M1主要通过Gq蛋白作用于磷脂酸肌醇系统激活磷脂酶C，生成IP3和DAG，增加细胞质中的Ca²⁺水平，导致支气管平滑肌收缩。气道平滑肌细胞上分布有高密度的KCA通道，平滑肌细胞收缩时，胞质内Ca²⁺浓度升高可激活该通道，K⁺外流使细胞复极化，平滑肌舒张。该通道是舒张的重要环节。M3在黏膜下腺体，调控气道水、黏液和电解质的分泌，也能开放肺泡上皮钠通道，增加肺泡上皮液体转运。在肺血管，当迷走神经受到刺激后，M3可能调节胆碱产生血管的舒张反应，其机制是由于激动血管内皮细胞M3亚型，导致内皮依赖性舒张因子即一氧化氮释放，从而引起邻近平滑肌细胞松弛。

受体拮抗剂长效性分析方法，具体地说是M3受体拮抗剂长效性分析新方法的发明及应用，所述的M3受体的拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵。长效抗胆碱药物以选择性阻断 M3受体的噻托溴铵为代表，是一种新型、高效、长效的季铵类吸入型抗胆碱药，目前已被广泛应用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的临床治疗中。

现有技术评价受体M3拮抗剂的长效性的方法存在以下问题：目前主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤、试验周期长及筛选通量低等不足等缺点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种新的、更方便、更简易且更高效的评价M3受体拮抗剂长效性的方法。

本发明的技术方案为：

1)基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；

2)对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；

3)利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；

4)根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。

进一步的，所述步骤1)中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。

进一步的，所述步骤1)中已知的激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。

进一步的，所述步骤2)中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：