[发明专利]一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物，是由质量比为1:(300～500):(700～900)的跨膜蛋白、脂质体、硅胶制成。本发明还提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相的应用。本发明构建了一种新型的跨膜蛋白‑脂质体‑硅胶复合物生物色谱固定相，并对制备方法学进行了考察，解决了蛋白脂质体键和色谱固定相的技术难题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物及其制备方法与应用。

背景技术

跨膜蛋白结构复杂，具有一个或多个疏水性的跨膜区，其纯化重组以及保存都离不开去污剂的存在。但是在去污剂存在的环境下，蛋白的结构和功能均遭到一定的破坏，药物与跨膜蛋白的相互作用也与体内实际情况差别较大。针对体外模拟跨膜蛋白天然构建这一难题，相关学者发展了一系列新的模型和分析技术，其中最具有代表性的就是蛋白脂质体重构技术，其原理是使用各种脂质体重组形成模拟细胞膜环境的人工膜，然后将跨膜蛋白镶嵌于其上，体外模拟跨膜蛋白天然构建和环境，来表征其与药物的相互作用。然而，蛋白脂质体不具备刚性结构，不能作为色谱固定相，因此无法适用于快速便捷的液质联用这类高效的药物分析方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物。

本发明的第二个目的是提供一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物，是由质量比为1:(300～500):(700～900)的跨膜蛋白、脂质体、硅胶制成，质量比优选的比值为1:400:800。

所述跨膜蛋白是镶嵌于脂质体双分子层中，两端暴露于细胞膜内外表面的蛋白质，具体选用的是细菌视紫红质蛋白、卷曲蛋白受体4(FZD4)。

所述脂质体为具有脂质双层结构的人工膜，是由摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺制成，摩尔比优选为80:20:5。

本发明的第二个方面提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物的制备方法，包括以下步骤：

将摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶剂充分震摇使其溶解，除去溶剂，加入PBS充分震荡重溶，孵育后超声成囊泡状，微孔滤膜过滤，获得所述脂质体；

将活化后的硅胶与脂质体混合1～60min，在冰浴条件下搅拌1～60min，温度为0～5℃的条件下静置保存过夜，然后在温度为0～5℃的条件下离心分离，沉淀用PBS重悬，重复该步骤2次，获得脂质体-硅胶复合物；

采用Cy3荧光标记试剂盒对细菌视紫红质蛋白进行标记，得到Cy3荧光标记的细菌视紫红质蛋白，蛋白终浓度为1～10mg/mL，将细菌视紫红质蛋白与脂质体-硅胶复合物孵育，获得细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物；

以上步骤中保持细菌视紫红质蛋白、脂质体、硅胶的质量比为1:(300～500):(700～900)；

或，

将摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶剂充分震摇使其溶解，除去溶剂，加入PBS以及FZD4蛋白充分震荡重溶、孵育，超声成囊泡状，微孔滤膜过滤，获得FZD4-脂质体复合物；