[发明专利]一种青蛤寡肽的制备方法

说明书

本发明涉及从青蛤中制备短肽的技术领域，为进一步提供青蛤寡肽的提取效率，本发明提供一种青蛤寡肽的制备方法，将离子液体EMIMBF4与γ‑丁内酯按体积比1:1复配二元体系应用在青蛤寡肽的制备上，并在‑50‑60℃低温下引入脉冲电场，结束后在前期优化的木瓜蛋白酶酶解条件下酶解处理，所得青蛤寡肽的提取率得到提高，而且生物活性也有一定程度的提高。

技术领域

本发明涉及从青蛤中制备短肽的技术领域，具体涉及一种青蛤寡肽的制备方法。

背景技术

青蛤(Cyclina sinensis)属于软体动物门，鳃瓣纲，异齿亚纲，帘蛤目、帘蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不饱和脂肪酸，味道鲜美，具有很好的营养价值。青蛤在民间入药具有悠久的历史，是一种重要的海洋药物，具有软坚散结、清热燥湿及镇咳作用。本申请的发明人团队在前期研究中以青蛤为原料制备了具有抗肿瘤作用的青蛤寡肽，见中国专利申请CN201610326511.1，发明名称“一种青蛤酶解寡肽的用途”，所得青蛤寡肽的氨基酸序列为Ile-Leu-Tyr-Pro，分子量为635.82Da。其制备方法为将青蛤匀浆后加入蛋白酶酶解，然后分离、纯化得到，该青蛤寡肽可应用在前列腺癌治疗、预防肿瘤食品等方面，具有很好的应用前景。因此，在前期研究基础上，如何进一步优化青蛤寡肽的制备方法，提高青蛤寡肽的提取率，并相应的提升青蛤寡肽的活性，具有重要的意义。

目前动物多肽的提取方法有匀浆、超声波、酶解等。由于离子液体表现的良好溶剂特性，目前也有用离子液体进行多肽提取的研究，但是离子液体低温下粘度增加，非常不利于操作。清华大学的骞伟中课题组在超级电容器的研究中发现，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配得到的二元体系可以保持较低的玻璃态温度，将超级电容器的工作温度下探至-70℃，表现了较好的低温特性。但是目前还未出现将这种二元体系应用在多肽提取上的研究。发明人团队在前期研究基础上，根据青蛤寡肽的短肽、低分子量特点，开展这种二元体系在青蛤寡肽提取方面的研究，以期提升青蛤寡肽的提取率。

发明内容

为进一步提供青蛤寡肽的提取效率，本发明方法在前期研究基础上，提供一种青蛤寡肽的制备方法，将离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1复配二元体系应用在青蛤寡肽的制备上，达到提高青蛤寡肽的提取率的目的。

本发明提供如下的技术方案：

一种青蛤寡肽的制备方法，所得青蛤寡肽的氨基酸序列为Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，包括以下步骤：

(1)将新鲜的青蛤洗净后、去壳，取内脏，清洗干净后匀浆处理得到青蛤匀浆液；

(2)将青蛤匀浆液与复配溶剂按料液比1:2～4混合均匀获得浸泡液，所用复配溶剂为离子液体EMIMBF4与γ-丁内酯按体积比1:1混合制成；

(3)降低浸泡液温度至-50～-60℃，向浸泡液中通入脉冲电场处理，然后升至室温；

(4)离心分离步骤(3)处理后的浸泡液，回收上清液，去离子水洗涤固体并离心分离得到内脏破碎物；

(5)向内脏破碎物中加入木瓜蛋白酶溶液处理得到酶解液，灭酶活性，离心分离；

(6)将步骤(5)中离心分离后的上清液经滤膜过滤后，超滤膜处理，截留分子量小于3kDa的分子段产物得到粗肽液；

(7)将粗肽液经层析分离，收集MIT法抑制率最高的峰对应的组份，然后经HPLC分离纯化，收集MIT法抑制率最高的峰对应的组份，冷冻干燥，得到青蛤寡肽。

作为本发明方法的优选，步骤(3)中的脉冲电场处理方法为：脉冲数为200～280次，电场强度17～20kV/cm，脉冲宽度为50～60μs，脉冲频率1500～2000Hz，浸泡液在-50～-60℃保持时间为7～8小时。

作为本发明方法的优选，步骤(4)中将浸泡液离心分离3～5次，然后去离子水洗涤3～5次并离心分离。