[发明专利]一种普适性的mRNA体外环化方法

权利要求书

1.一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1.制备纯化的mRNA；

S2.对步骤S1的mRNA的5’端进行单磷酸化修饰，并在3’端加上poly(A)；

S3.将经步骤S2处理后的mRNA与DNA splint进行杂交反应，得到杂交产物；

S4.向杂交反应的体系中加入DNA连接酶，对杂交产物进行环化处理，得到环化产物；

S5.消化体系中多余的DNA splint，然后对环化产物进行验证；

其中所述DNA splint的长度为60nt，且其5’端为30nt的poly(T)，3’端为30nt的可与所述修饰后的mRNA的5’端互补配对的碱基。

2.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S2中，采用腺苷三磷酸双磷酶进行所述单磷酸化修饰。

3.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S2中，采用poly(A)聚合酶在3’端加上poly(A)。

4.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S3中，所述杂交反应的具体步骤为：在10μL的反应体系中，加入1.6pmol经步骤S2处理后的mRNA和0.1μL的100μmol/L DNA splint，先加热至80℃并保温3min，再逐渐降温至25℃。

5.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S4中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶，且终浓度为20μmol/L。

6.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S4环化处理后，纯化所述环化产物。

7.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S5中，所述消化方法为：向体系中加入终浓度为0.2U的DNaseⅠ，37℃条件下孵育1h。

8.根据权利要求1所述的一种普适性的mRNA体外环化方法，其特征在于，步骤S5中，所述验证方法为：将所述环化产物进行逆转录得到cDNA，然后以该cDNA为模板，在环化产物的连接处的两侧300bp的位置设计正向和反向引物，进行PCR扩增反应，PCR产物进行凝胶电泳并切胶回收，回收的产物构建进pUC19质粒后再进行测序验证。