[发明专利]一种普适性的mRNA体外环化方法

说明书

本发明公开了一种普适性的mRNA体外环化方法，步骤为：制备纯化的mRNA；对mRNA的5’端进行单磷酸化修饰，并在3’端加上poly(A)；将修饰后的mRNA与DNA splint杂交；向杂交反应体系中加入T4DNA连接酶进行环化；消化体系中多余的DNA splint，然后对环化产物进行验证；其中所述DNA splint的长度为60nt，且其5’端为30nt的poly(T)，3’端为30nt的可与修饰后的mRNA的5’端互补配对的碱基。本发明的有益效果是:(1)在mRNA的3’端加上了poly(A)，便于DNA splint的序列设计和mRNA两端缺口对齐，增强了mRNA的体外环化效率，利于后续翻译过程；(2)采用腺苷三磷酸双磷酶对mRNA的5’端进行单磷酸化修饰增强了环化效率；(3)T4 DNA连接酶的酶促方法没有底物差异性，具有普适性。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种普适性的mRNA体外环化方法。

背景技术

自2013年Hansen TB和Memczak S等人的两篇刊载在《nature》上的研究论文提出哺乳动物细胞内的环状RNA对细胞生命活动有重大调节作用以来，环状RNA近年来引起了科研工作者的广泛关注。根据相关研究可知，环状RNA可行使“microRNA海绵机制”，通过竞争性结合miRNA从而间接影响mRNA，在多种疾病的发生发展过程中起到了重要的调控作用。目前有研究证明一些内源于果蝇和人类的环状RNA可以编码蛋白质，即具有与mRNA相同的生物功能。而且，环状RNA缺乏外切核酸酶介导的降解所必需的游离末端，使得它们对RNA降解的几种机制具有抗性，即与线性mRNA对应物相比具有更长的寿命。因此，将mRNA环化可以延长mRNA的半衰期，从而提高外源mRNA在各种应用中的总体功效。

目前通常认为自然情况下环状RNA的形成是通过反向剪接反应，即将基因5'端的剪接位点与上游内含子的3'剪接位点连接而产生的。因此目前mRNA体外环化策略也是采用与体内环状RNA形成类似的策略即自剪接内含子的核酶法。然而该方法对基因序列的要求很高，不具有较好的普适性。

已有文献(Splint ligation of RNA with T4 DNA ligase.ChristopherJ.Kershaw and Raymond T.O’Keefe.Methods Mol Biol.2012；941:257–269)报道了可利用T4 DNA连接酶和DNA splint实现RNA的连接和环化，然而该方法仅用T4多聚核苷酸激酶对RNA的5’端进行单磷酸化修饰，利于T4 DNA连接酶的连接，然而长链RNA如mRNA的末端会出现长短不齐的问题，进而导致mRNA的两端缺口无法对齐，mRNA的成环效率低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，对mRNA的5’端进行单磷酸化修饰的同时在mRNA的3’端加上poly(A)，然后用DNA splint和T4 DNA连接酶进行环化，提供了一种具有普适性且mRNA的成环效率更高的mRNA体外环化方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种普适性的mRNA体外环化方法，包括以下步骤：

S1.体外转录并纯化获得mRNA；

S2.对步骤S1的mRNA的5’端进行单磷酸化修饰，并在3’端加上poly(A)；

S3.将经步骤S2处理后的mRNA与DNA splint进行杂交反应，得到杂交产物；

S4.向杂交反应的体系中加入DNA连接酶，对杂交产物进行环化处理，得到环化产物；

S5.消化体系中多余的DNA splint，然后对环化产物进行验证；

其中所述DNA splint的长度为60nt，且其5’端为30nt的poly(T)，3’端为30nt的可与所述修饰后的mRNA的5’端互补配对的碱基。