[发明专利]用于单细胞DNA测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒

说明书

本发明提供了用于评估单细胞DNA测序文库质量的24对引物，利用这24对引物对中的八对或更多对能够准确评估单细胞DNA测序文库的基因组完整性和均一性，进而指导单细胞DNA测序。本发明还提供了利用这24对引物对中的八对或更多对来评估单细胞DNA测序文库质量的方法和试剂盒。

技术领域

本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域；具体地说，本发明涉及单细胞DNA测序文库质量鉴定的引物对、方法和试剂盒。

背景技术

近几年来，随着细胞分离技术、单细胞扩增技术和测序技术的发展，单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，为基础研究向临床转化搭建了桥梁。单细胞测序包括单细胞DNA和RNA测序，分别针对单个细胞的DNA和RNA进行序列分析和比较，进而揭示基因组和转录组的变化。

单细胞DNA测序技术是指在单个细胞水平上对DNA进行扩增和测序的一项新技术，包括单细胞全基因组测序、单细胞全外显子测序和单细胞靶向基因测序等。传统的DNA测序方法通常使用数百万甚至更多细胞的混合DNA测序，如Sanger测序或Illumina测序，这些方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特异性被忽视。利用单细胞DNA的深度测序，可以广泛地研究细胞的功能，例如循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)，早期发育的胚胎细胞等。与典型的高通量测序实验一样，单细胞测序方案一般包括以下步骤：单细胞的分离和抓取、核酸的提取和扩增、测序文库的制备，高通量测序和生物信息学数据分析。与批量细胞DNA测序相比，进行单细胞DNA测序更具挑战性。传统的测序方法DNA起始量需要纳克或微克级，单个细胞的DNA量只有皮克级，样品制备过程中的任何损失、降解和污染对测序数据的质量产生显著的影响。此外，由于起始样本DNA量低，在单细胞测序文库制备过程中经常需要大量扩增，容易导致测序数据的覆盖不均匀、较多的信号噪音和量化不准确。因此，在单细胞DNA全基因组测序，尤其是单细胞全外显子捕获、目标基因靶向捕获测序前对文库进行全面的质量评估是非常有必要的。

传统测序文库质量评估的方法主要有：1、荧光定量法，该方法是基于荧光染料与核酸分子结合，发出的荧光信号强度与结合的核酸分子数成正比的原理设计的。代表性的方法是Qubit荧光定量仪及配套试剂，该方法缺点是只能进行核酸定量，无法对文库质量进行评估；2、片段分析法，通过常规电泳或基于芯片的微流体技术对样本进行分离，根据电泳图谱或收集到的荧光信号对样本进行定量和片段分析，代表性的方法是Agilent 2100片段分析仪及配套试剂，该方法通过与已知片段大小和浓度的DNA Marker比较，进行样本的定量和分段分析，根据文库的片段分布判断文库质量；3、荧光定量PCR法，该方法采用文库接头序列引物或探针进行qPCR检测，检测的目标序列为文库接头，可以对测序DNA文库进行精确定量。这些方法共有的缺点是无法对测序文库的质量进行评估，如基因组完整性和均一性。单细胞DNA测序文库的特点是起始样本是一个细胞或少数细胞，测序前样本制备过程中需要经过大量扩增，可能会产生扩增的非特异性和偏好性，导致文库基因组完整性和均一性较差。传统的测序文库质量评估方法只能进行定量或片段大小分析，无法评估文库的基因组完整性和均一性，从而影响单细胞测序的质量，尤其是影响单细胞全外显子捕获测序、目标基因靶向测序的质量。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种单细胞DNA测序文库质量鉴定的方法和试剂盒，用于评估文库基因组完整性及均一性，从而评估单细胞文库是否适合全基因组测序，或全外显子捕获测序和目标基因靶向捕获测序。

在第一方面，本发明提供一种引物对的组合，所述引物对的组合包括下表所示24对引物对中的8对或更多对：

在优选的实施方式中，所述引物对的组合用于单细胞DNA测序文库质量鉴定。