[发明专利]一种共固定化酶及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及一种共固定化酶及其制备方法和用途，所述共固定化酶是以海藻酸钠‑CaCl₂凝胶和活性炭为载体，将过氧化氢酶和漆酶进行固定。所述共固定化酶采用包埋法和物理吸附法两种方法相结合进行固定化，所得到的共固定化酶的耐热性、耐酸碱性、贮存稳定性和操作稳定性均得到明显提升，对苯胺废水具有优异处理效果，对苯胺废水的操作稳定性较好，可以极大地降低实际应用于废水处理的成本。

技术领域

本发明涉及酶固定技术，尤其是一种共固定化酶及其制备方法和用途。

背景技术

共固定化酶指通过把两种及以上的酶同时在同一个载体内进行固定化而产生共固定化体系的一种固定化技术。共固定化酶可以充分发挥不同种酶的各自催化特点，结合各自的酶催化特性，将两者协同起来充分利用，增加其对于复杂底物的催化反应效率。同时可减少其反应的步骤和时间，能更好地提升产品的效能。

现有技术中有学者将纤维素酶和溶菌酶共固定化于氨基功能化磁性纳米颗粒表面，用于细胞壁降解反应。固定化过程中纤维素酶与溶菌酶的竞争是由于MNPs活性位点有限所致。最大限度活性位点中78.9％纤维素酶和69.6％溶菌酶是双酶共固定化的协同效应。共固定化酶半衰期的热稳定性为3h，对细胞壁水解具有较高的催化效率。此外，与游离酶相比，共固定化酶具有更高的热稳定性和较宽的pH耐受性。经过再循环6次使用后，共固定化酶保留了60％的残余活性。

专利申请CN107012138A公开了一种硅/碳基复合固定化酶环保材料及其制备方法。该环保材料是将复合生物酶固定化于改性处理后的硅-碳基载体上，这些载体含有纳米尺度微晶结构共聚体，形成改性硅-碳基固定化酶生物材料。这种材料必须先经过改性，操作复杂。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的酶固定技术不足，材料的稳定性不佳的问题，提供一种共固定化酶及其制备方法和用途。

本发明的关键之一在于制备出酶与载体结合效果好的共固定化酶，发明人发现，其影响因素从主到次的排列为：活性炭投加量>海藻酸钠浓度>CaCl₂浓度。由于活性炭的影响最大，则其投加量越多吸附越好，而对于海藻酸钠溶液和CaCl₂溶液，两者浓度越高胶球内部各组分就越紧密而不利于底物的传质，产生位阻效应。故最优方案为：复合酶溶液200mL，活性炭投加量为0.15g，海藻酸钠浓度为2％，CaCl₂浓度为2％。在该条件下，该空碳胶球的吸附性能和传质效果最佳，若将游离酶附着在胶球内制备出固定化酶，底物在胶球中进出也更容易，即传质效果更好，且内部酶与其底物会得到更好的接触效果，从而催化反应速率更高，可表现出更好的酶活性，因此在本研究中采用该条件来制备固定化酶。

本发明所使用的固定化载体是海藻酸钠-活性炭复合载体，采用吸附和包埋的方法对漆酶和过氧化氢酶进行共固定，与常规固定化载体和固定化方法具有明显的不同之处。因此，本发明的固定化方法操作性更加简单，固定材料也较简易；且本发明的复合载体无需改性。

具体方案如下：

一种共固定化酶，所述共固定化酶是以海藻酸钠-CaCl₂凝胶和活性炭为载体，将过氧化氢酶和漆酶进行固定。

进一步的，所述共固定化酶的最适温度为45℃；

任选的，所述共固定化酶的操作稳定性高，在25℃下经过5次的循环使用后，过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过61％和超过74％的活性。

进一步的，所述共固定化酶的贮存稳定性好，在4℃下贮存30日后，固定化过氧化氢酶和漆酶仍然保留超过65％和超过61％的活性。

一种所述的共固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置过氧化氢酶和漆酶的混合缓冲溶液；