[发明专利]葡萄香气糖苷的提取纯化方法及其建库鉴定量化方法

权利要求书

1.一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法，其特征在于：包括以下操作步骤：1)葡萄浆果的选择；2)葡萄果皮的剥离；3)香气糖苷的提取；4)香气糖苷的分离纯化前处理；5)香气糖苷的分离纯化处理。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法，其特征在于：具体的步骤为：

所述步骤1)葡萄浆果的选择：原料采收时，测定浆果的糖、酸，同时参考葡萄果皮的着色情况，选择成熟度好、完好、健康、卫生的葡萄果粒；

所述步骤2)葡萄果皮的剥离：将葡萄果实经冷冻复溶后剥取葡萄外果皮；

所述步骤3)香气糖苷的提取：将葡萄果皮浸泡在甲醇中，果皮的重量与甲醇浸提液的体积比值为2:1，加入50mg/L抗坏血酸防止香气糖苷的氧化，加入1g/L葡萄糖酸内酯以抑制葡萄糖苷酶的活性，防止香气糖苷的水解，于避光条件下，4℃浸提48小时，得糖苷浸提液；

所述步骤4)香气糖苷的分离纯化前处理：将糖苷浸提液用旋转蒸发仪于40℃旋转蒸发去除甲醇，然后经0.45μm水系滤膜过滤，得到的香气糖苷提取液，收集于棕色玻璃瓶，存放于4℃冰箱；

所述步骤5)香气糖苷的分离纯化处理：玻璃层析柱湿法装填XAD-2大孔树脂，填充高度为7.5倍柱内直径，随后，依次用二氯甲烷、甲醇、超纯水活化XAD-2大孔树脂，取香气糖苷提取液加入大孔树脂中，样品吸附12h，然后用超纯水过柱，去除色素、有机酸和糖类等高极性杂质物质；戊烷/二氯甲烷过柱，洗脱游离态香气成分，乙酸乙酯/甲醇过柱，洗脱收集香气糖苷物质。

3.如权利要求1所述的香气糖苷的分离纯化建库鉴定量化方法，其特征在于：包括以下步骤：1)香气糖苷的LC-MS分析前处理；2)香气糖苷谱库的建立；3)香气糖苷的LC-MS分析；4)香气糖苷的定性分析；5)香气糖苷的量化分析。

4.根据权利要求3所述的香气糖苷的分离纯化建库鉴定量化方法，其特征在于：具体步骤为：

所述步骤1)香气糖苷的LC-MS分析前处理：将步骤1)中所得到的香气糖苷物质于40℃旋转蒸发去除乙酸乙酯/甲醇后，真空冷冻干燥制备香气糖苷固体，低温储藏至分析；

所述步骤2)香气糖苷谱库的建立：对香气糖苷进行糖苷酶催化水解，气相色谱-质谱联用分析游离苷元、高效液相色谱分析糖基，以及核磁共振分析香气糖苷分子相关检测，通过结构解析、离子碎片比对、分子结构重组手段，建立了含41种香气糖苷的谱库，包含香气糖苷的结构式、分子式信息；

所述步骤3)香气糖苷的LC-MS分析：香气糖苷固体复溶于10mL色谱甲醇，取1.5mL经0.22μm有机滤膜过滤后，进样分析；

液相条件：样品室温度10℃；梯度洗脱溶剂为：流动相A为质谱级乙腈，流动相B为超纯水(0.1％质谱级甲醇)，运行时间为50min，洗脱梯度为：5％A(0-8min)，5％-45％A(8-18min)，45％-65％A(18-23min)，65％-90％A(23-27min)，90％A(27-37min)，90％-5％A(37-47min)，5％A(47-50min)，流动相梯度曲线为5，柱温为45℃；流速为0.4mL/min，进样量10μL；

质谱条件：采用电喷雾(ESI)离子源，MSe检测模式，质量扫描范围：m/z50-1200，毛细管电压2kV，样品锥电压40V，离子源温度120℃，脱溶剂气温度400℃，脱溶剂气流速600L/h，采用亮氨酸脑啡肽(LE)适时校正，校正质荷比(Lock mass)m/z 554.2615，高能碰撞电压为10-45V；

所述步骤4)香气糖苷的定性分析：为利用上述步骤2)中的自建糖苷数据库，用UPLC-QTOF-MS的相关分析软件进行糖苷的分子式和结构鉴定；

所述步骤5)香气糖苷的量化分析：为以辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷为内标，样品中的香气糖苷检出量以内标的相对含量表示。