[发明专利]葡萄香气糖苷的提取纯化方法及其建库鉴定量化方法

说明书

本发明公开了一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法及其建库鉴定量化方法，包括葡萄果实的选择、取皮，萜烯类香气糖苷的提取、分离、纯化，萜烯类香气糖苷质谱谱库的建立，萜烯类香气糖苷的LC‑MS分析，萜烯类香气糖苷质谱谱库的使用及萜烯类香气糖苷的定性、定量分析。本发明方法成本低，提取效率高，方法的系统配套建立保证了研究的准确性和可靠性。本研究建立的方法在实际分析中，简易可行，具有很好的推广应用价值。

一、技术领域：

本发明涉及天然香气物质的化学分析方法，具体涉及一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法及其建库鉴定量化方法。

二、背景技术：

萜烯类香气糖苷是水果、茶叶、花卉及其加工产品中重要的呈香前体物质，具有水解生成游离态萜烯类香气物质的呈香潜力，因而成为现阶段的研究热点。葡萄酒的典型香气特征取决于发酵过程中葡萄果皮上香气前体物质的释放水解，萜烯类香气糖苷是其中极其重要的一类，有学者将葡萄中香气糖苷的总量作为判别葡萄芳香类型的依据。由于目前萜烯类香气糖苷的人工合成困难，市场上缺乏萜烯类香气糖苷的标准品，研究葡萄萜烯类香气糖苷前体物质的化学结构，一般采用糖苷酶水解或酸性环境下水解，通过气相色谱鉴定水解释放的挥发性苷元来推测其化学结构。但水解环境常常造成释放苷元的分子重排，导致气相色谱鉴定结果不能反应糖苷的真实苷元组成，并且糖基部分也不能从气相色谱中定性。因此，液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术在近年来的研究中逐渐被开发，通过质谱离子的碎片分子量推测萜烯类糖苷的化学结构。尽管LC-MS技术应用于萜烯类香气糖苷的分析已有不少报道，但相关研究的定性鉴定仍停留在糖苷制备、质谱离子碎片比对、苷元确认上，鉴定的萜烯类糖苷种类受到限制，还没有形成可以推广的萜烯类香气糖苷的质谱谱库，严重限制了萜烯类香气糖苷的LC-MS鉴定分析。

三、发明内容

有鉴于此，本发明提供一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法及其建库鉴定量化方法，弥补了我国在葡萄萜烯类香气糖苷的定性定量分析研究领域的空白，完善了葡萄萜烯类香气糖苷的分析链，为深入挖掘葡萄与葡萄酒中萜烯类香气糖苷资源提供了可鉴方法，为葡萄酒增香酿造理论的深入阐述提供了可行的技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种葡萄香气糖苷的提取纯化方法，其特征在于：包括以下操作步骤：1)葡萄浆果的选择；2)葡萄果皮的剥离；3)香气糖苷的提取；4)香气糖苷的分离纯化前处理；5)香气糖苷的分离纯化处理。

所述步骤1)葡萄浆果的选择：原料采收时，测定浆果的糖、酸，同时参考葡萄果皮的着色情况，选择成熟度好、完好、健康、卫生的葡萄果粒；

所述步骤2)葡萄果皮的剥离：将葡萄果实经冷冻复溶后剥取葡萄外果皮；

所述步骤3)香气糖苷的提取：将葡萄果皮浸泡在甲醇中，果皮的重量与甲醇浸提液的体积比值为2∶1，加入50mg/L抗坏血酸防止香气糖苷的氧化，加入1g/L葡萄糖酸内酯以抑制葡萄糖苷酶的活性，防止香气糖苷的水解，于避光条件下，4℃浸提48小时，得糖苷浸提液；

所述步骤4)香气糖苷的分离纯化前处理：将糖苷浸提液用旋转蒸发仪于40℃旋转蒸发去除甲醇，然后经0.45μm水系滤膜过滤，得到的香气糖苷提取液，收集于棕色玻璃瓶，存放于4℃冰箱；

所述步骤5)香气糖苷的分离纯化处理：玻璃层析柱湿法装填XAD-2大孔树脂，填充高度为7.5倍柱内直径，随后，依次用二氯甲烷、甲醇、超纯水活化XAD-2大孔树脂，取香气糖苷提取液加入大孔树脂中，样品吸附12h，然后用超纯水过柱，去除色素、有机酸和糖类等高极性杂质物质；戊烷/二氯甲烷过柱，洗脱游离态香气成分，乙酸乙酯/甲醇过柱，洗脱收集香气糖苷物质。

香气糖苷的分离纯化建库鉴定量化方法，其特征在于：包括以下步骤：1)香气糖苷的LC-MS分析前处理；2)香气糖苷谱库的建立；3)香气糖苷的LC-MS分析；4)香气糖苷的定性分析；5)香气糖苷的量化分析。