[发明专利]基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法及所用引物

说明书

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于核酸飞行质谱的检测基因多态性的方法；本发明通过核酸飞行质谱技术，可以一次性筛查6种遗传性疾病的7个基因的159个热点突变位点。具体而言，本发明公开了一种基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物，为针对如下6种遗传病的7个基因进行设计：alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症；引物包括PCR正、反向引物以及单碱基延伸引物。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于核酸飞行质谱的检测基因多态性的方法。本发明通过核酸飞行质谱技术，可以一次性筛查6种遗传性疾病的7个基因的159个热点突变位点。

背景技术

单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁，在新生儿领域，危害最大的包括苯丙酮尿症、地中海贫血、甲基丙二酸血症等，这些单基因遗传病的特点都是隐性遗传，父母双方均为携带者，形成纯合或复合杂合之后，便会致病。同时这些遗传代谢病与其他遗传病不同，这些遗传代谢病一旦早期发现，是可以通过干预手段完全避免发病，或者大大轻减症状。而如果对父母进行筛查，则可以对携带有相同致病突变基因的父母进行预警，通过产前诊断的方式阻断相应的患儿出生。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸飞行质谱技术，对常见的6种遗传病，包括alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症共7个基因的159个突变位点，通过6个反应孔，进行基因测序与分型，从而筛查出致病基因携带人群。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物：为针对如下6种遗传病的7个基因进行设计：alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症；

引物包括PCR正、反向引物以及单碱基延伸引物。

作为本发明的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物的改进：PCR正、反向引物如表1(6种疾病7个基因的共159的引物序列)所述。

作为本发明的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物的进一步改进：所述单碱基延伸引物如表2(159个位点的延伸引物)所述。

在本发明中，通过网上clinvar、HGMD数据库，查找到出现频率较高的突变位点，然后进行设计。例如以叶酸代谢的C677T为例，从662-677设计一段16个碱基的引物，前15个碱基固定不变，第16个碱基，如果是野生型就是C，如果是突变型就是T。

三条序列的分子量不同，通过质谱方式检测分子量大小，从而判断出该突变位点是杂合，还是野生型，还是纯合突变型。

本发明还同时提供了利用上述引物进行的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法，依次进行如下步骤：

1)、PCR扩增：

PCR扩增体系：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、0.1μM的PCR引物、PCR高保真酶、待测样本的DNA，水定容至5μL；

表1中编号(表1中第1列所述)相同的PCR引物在一个PCR体系中反应；

即，所有W1的混合在一起，所有W2的混合在一起，依次类推；

PCR扩增体系：

2)、SAP反应：

在步骤1)所得的PCR扩增中加入含SAP酶的SAP混液形成SAP反应体系；所述SAP反应体系中SAP酶的浓度为0.5U/ul；

反应程序：