[发明专利]乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法

权利要求书

1.一种乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)细胞培养

HMY2-CIR细胞株的培养液是在DMEM高糖培养基中加入了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，并且调节成不同的pH值；培养条件为5％CO₂，37℃；

(2)低pH培养基制备

20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH计测试溶液的pH值，并且在培养基中加入盐酸将溶液的pH值调至5.6和6.0；

(3)细胞形态学检测

HMY2-CIR细胞分别用pH7.4,6.0和5.6的培养基培养八周，每三天换一次培养基，然后利用甩片机将细胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液进行染色；

(4)细胞增殖的测定

细胞增殖是用Alamar Blue assay进行检测：将相同数量的HMY2-CIR细胞200μl加入96孔培养板中，并在每个孔中加上不同pH的培养基，用DMSO作为对照，培养三天后，在每个孔中加入10μl的Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO₂的条件下继续培养2小时，用SpectraMaxM5 multi-detection reader读取560nm至590nm的吸光度值；

(5)集落生成实验

HMY2-CIR细胞在不同pH值的培养液中培养了8周后，用新鲜的培养基洗两遍，并且重悬计数；取1×10³个活细胞与Methocult H4230 methylcellulose混合后置于30mm培养皿中，并于37℃和5％CO₂条件下培养14天；14天后，对克隆的数量进行计数，大于50个细胞算作克隆，并用体视显微镜进行拍照；

(6)RT-PCR

从用乳酸处理过的HMY2-CIR细胞中提取总RNA；然后用RevertAid First Strand cDNASynthesis试剂盒和oligo(dT)引物进行逆转录，每20μL反应体系中含有5μg总RNA，还需要加入RNase-free DNase I；每一个25μL的RT-PCR反应体系中含有1μL cDNA和1μL TaKaRaTaq DNA聚合酶；反应条件为94℃4分钟,94℃30秒，25-35个循环,58–68℃30秒,72℃1分钟.RT-PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离；所用的引物序列在表I中列出：

(7)数据分析

数据都是均值±方差；组别之间的差异都是用SPSS 16.0软件进行分析；*P0.05代表有差异，**P0.01代表差异显著。

2.根据权利要求1所述的乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法，其特征是：人B淋巴母细胞HMY2-CIR在含有20mM乳酸的培养液中培养72小时，并用Alamar Blue assay检测细胞的增殖情况，*P0.05；

人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，细胞计数后取1000个活细胞，加入甲基纤维素中，混匀后置于培养箱中；14天后，计数集落的数量，并用体式显微镜进行拍照，对计得的集落数量进行统计学分析，**P0.01；

人B淋巴母细胞HMY2-CIR在20mM乳酸中培养8周后收取细胞，提取总RNA后用RT-PCR检测多个原癌基因的表达情况，条带的灰度用Quantity One软件进行扫描，并进行统计；这些实验数据至少重复三次；*P0.05；**P0.01。