[发明专利]乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法

说明书

本发明公开了一种一种乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法，包括细胞培养、低pH培养基制备、细胞形态学检测、细胞增殖的测定、集落生成实验、RT‑PCR、数据分析等步骤。本发明方法方便、准确。

技术领域

本发明涉及一种乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法。

背景技术

自从Otto Warburg在1956年提出著名的“无氧糖酵解理论”，认为无氧糖酵解在肿瘤的发生中起了至关重要的作用，无氧代谢也被认为是肿瘤的标志物之一。即使在氧存在的情况下，肿瘤细胞也主要依赖分解糖原产生能量，导致高浓度的乳酸的产生和堆积。乳酸有很多作用。一方面，无氧糖酵解能够产生能量，维持肿瘤细胞的生长和其他活动；另一方面，糖酵解产生的乳酸能使肿瘤微环境的pH值降低，创造一个能够促进肿瘤发生发展和转移的酸性环境。越来越多的证据显示，曾经被认为是代谢废物的乳酸，能够作为一个调控因子，在肿瘤的发生发展和转移中起到重要的调节作用。确实，实验证明，在多种肿瘤类型比如淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中，组织和细胞中乳酸的浓度和肿瘤的发生、转移和肿瘤病人的预后差密切相关。因此，乳酸含量和酸性微环境已经被公认为是肿瘤诊断和抗肿瘤治疗的标志物。

全世界的科学家都试图阐明无氧代谢与肿瘤发生发展之间的关系。乳酸通过促进细胞“干性”相关基因或者转录因子如SP1,MAZ, MEIS1等高表达或过表达使细胞重编程。Ubaldo等曾报道，乳酸能够增加细胞的干性。但是，乳酸促进淋巴瘤的发生的机制还不明确。

二代测序技术和基因表达谱分析表明，淋巴瘤的起始和发展与原癌基因的多位点突变导致与肿瘤发生相关的信号通路的激活密切相关。除此之外，高浓度的乳酸和酸性肿瘤微环境也常见于淋巴瘤病人中，对淋巴瘤病人的病情恶化起了一定的推动作用。但是，乳酸引起淋巴瘤恶化的机制迄今还不明确。我们猜想，乳酸可能是通过促进淋巴瘤发生过程中关键的原癌基因的表达来实现的，而这些原癌基因有哪些迄今还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便、准确的乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法。

本发明的技术解决方案是：

一种乳酸/酸性环境促进无致瘤性的淋巴母细胞去分化获得致瘤性的研究方法，其特征是：包括下列步骤：

(1)细胞培养

HMY2-CIR细胞株的培液是在DMEM高糖培养基中加入了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，并且调节成不同的pH 值；培养条件为5％CO₂，37℃；

(2)低pH培养基制备

20mM乳酸溶解于上述DMEM中，用pH计测试溶液的pH值，并且在培养基中加入盐酸将溶液的pH值调至5.6和6.0；

(3)细胞形态学检测

HMY2-CIR细胞分别用pH7.4,6.0和5.6的培养基培养八周，每三天换一次培养基，然后利用甩片机将细胞黏附到玻片上，用瑞姬氏染液进行染色；

(4)细胞增殖的测定

细胞增殖是用Alamar Blue assay进行检测：将相同数量的 HMY2-CIR细胞200μl加入96孔培养板中，并在每个孔中加上不同pH 的培养基，用DMSO作为对照，培养三天后，在每个孔中加入10μl的 Alamar Blue染液。并在37℃，5％CO₂的条件下继续培养2小时，用SpectraMax M5 multi-detection reader读取560nm至590nm 的吸光度值；

(5)集落生成实验