[发明专利]细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。所述方法包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。该方法可以显著缩短检测时间，最快约10分钟左右即可完成检测，且检测准确度好，效率高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。

背景技术

真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。细胞周期进展是通过许多细胞周期调节相关的信号通路(特别是周期蛋白相关通路)在规定时间和空间激活或关闭来严格控制的，它们在细胞周期期间呈现高度的动态性。例如，在特定的细胞周期阶段，一些蛋白质从细胞核转移到细胞质，或者相反，以及一些蛋白质被迅速降解等。

细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的。

目前细胞周期检测方法通常有以下几种：

1.同位素标记法测定细胞周期

标记有丝分裂百分率法(percentage labeled mitoses，PLM)是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

2.基于成像的荧光检测法

FUCCI(fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator,FUCCI)小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中geminin融合的是绿色荧光基团AmCyan，而Cdt1融合的是红色荧光基团mCherry。Cdt1和geminin的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1蛋白水平在G1阶段达到峰值，而geminin蛋白水平在S、G2和M期不断升高。这一结果体现为表达FUCCI细胞核在G1期为红色而在S、G2和M期则呈现绿色。

3.流式细胞术PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)染色法

由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。主要方法简述如下：收集细胞；加入75％乙醇；放置过夜(大于24小时)；洗涤后RNase I(RNA酶I，10mg/ml，无DNA酶活性)消化并PI(1mg/ml)染色；上机检测。

然而方法1放射性污染严重，设备要求极高。

方法2操做复杂且设备要求高，单次实验成本高。

方法3流式细胞术PI染色法是主流检测方法。然而整个检测从细胞准备好后，加入75％乙醇作用，细胞固定同时被打孔，至少需要花费24小时才能上机检测，对于药企研发和科研研究来说造成了很大的时间损耗。且方法3中，乙醇固定、PI染色与RNA消化是分三步进行的，耗时耗力。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种细胞周期检测方法，包括：使用0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。