[发明专利]一种巢式PCR试剂盒

说明书

本发明提供一种巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。本发明的试剂盒操作简单快捷、扩增效率高和污染风险低。

技术领域

本发明PCR技术领域，具体涉及一种巢式PCR试剂盒。

背景技术

巢式PCR是一种使用两对引物进行两轮扩增的PCR技术，巢式PCR一般使用一对外部引物进行第一轮扩增，然后以第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用一对内部引物(也称为巢式引物)进行第二轮扩增。巢式PCR克服了普通PCR单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性。由于模板和引物的改变，降低了非特异反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。得益于巢式PCR的高灵敏度和高特异性，巢式PCR广泛应用于病原体检测、肿瘤等疾病的伴随诊断中。

巢式PCR在实际应用中仍存在一些问题。外部引物加入量过低，则影响第一轮扩增的扩增效率，外部引物加入量过高，则外部引物残留可能对第二轮扩增造成影响。目前常用的解决方案是增加第一轮PCR的循环数，尽量消耗外部引物，然后对第一轮PCR产物进行高倍稀释，以降低进入第二轮PCR的残留外部引物量。但是，在临床应用上，增加第一轮PCR循环数会增加整个临床检测的时间，而且对高拷贝数的第一轮PCR产物进行稀释或其他操作很容易造成PCR产物污染，不利于临床检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种巢式PCR试剂盒，该PCR试剂盒在保持高扩增效率的同时，解决了巢式PCR外部引物残留而对第二轮PCR造成的影响，并且严格控制了第一轮PCR扩增循环数和产物量，适用于临床检测。

在第二轮PCR扩增前，在PCR混合液中添加UNG酶，并设置合适的孵育温度和时间即可消除第一轮PCR扩增引物。由于UNG酶在PCR循环中95℃变性步骤中可被灭活，因此不会影响后续实验。高品质的UNG酶可以消除高达10⁸的含dU PCR产物。

在一种实施方式中，本发明提供一种巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括进行第一轮PCR扩增的一对外部引物和进行第二轮扩增的一对巢式引物，第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，然后再使用所述巢式引物进行第二轮扩增；其中第一轮的一对外部引物的上游和/或下游引物对于所述第二轮扩增的特异性有影响，所述一对外部引物的上游和/或下游引物中dT全部用dU代替，并且第二轮PCR扩增体系中包括UNG酶，其在第二轮扩增前用于消化所述一对外部引物的上游和/或下游引物。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是巢式数字PCR试剂盒。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒是非小细胞肺癌EGFR基因20ins突变检测的巢式数字PCR试剂盒。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第一轮上游引物是SID No.6:CCACACUGACGUGCCUCUCC；和第一轮下游引物是SID No.7:AGGCAGCCGAAGGGCA。

在一种实施方式中，所述巢式PCR试剂盒中第二轮上游引物是上游ARMS引物SIDNo.8:GTGGACAACCCCCACCAC；和第二轮下游引物是SID No.9:CGGTGGAGGTGAGGCAGAT。

本发明试剂盒具有以下优点，本发明实现了如下技术效果：

1)操作简单快捷：不需要增加第一轮PCR的循环数，不需要对第一轮PCR产物进行稀释。

2)扩增效率高：检出拷贝数/投入拷贝数达到了10倍，能满足放大低丰度模板的需求。