[发明专利]一种慢病毒转导滴度的测定方法

说明书

本发明公开了一种慢病毒转导滴度的测定方法。本发明所提供的测定慢病毒转导滴度的方法，包括如下步骤：将待测慢病毒的稀释液加入到K562细胞中进行感染，72小时后测定K562细胞阳性率，进而计算得到所述待测慢病毒的转导滴度。本发明免除了贴壁细胞繁琐的铺板过程，缩短了整个检测的时间，提高了工作效率；一定范围内，K562细胞的阳性率与慢病毒加入量具有较好的相关性；在一定范围内，相同的病毒加入量，K562细胞与T细胞的阳性率具有较高的相关性；K562比293FT细胞对慢病毒更敏感，用K562测定转导滴度的方法灵敏度高，所得转导滴度结果能更直接指导T细胞的病毒使用量。

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，特别涉及一种慢病毒转导滴度的测定方法。

背景技术

CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是当今最新最有效的治疗肿瘤的“活体药”。从1993年ZeligEshhar与Steven Rosenberg联合发表了第一代CAR-T细胞研究到2012年4月，7岁的Emily成为世界第一例儿童急性淋巴细胞白血病CAR-T受试者，CAR-T技术得到了飞速发展，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。

CAR-T免疫细胞治疗的作用机理是利用基因工程技术手段，特异性改造患者自身的免疫T细胞，使其能够识别肿瘤细胞，从而实现特异性杀伤的作用。其治疗流程主要有：(1)从癌症患者体内分离免疫T细胞；(2)经过基因工程手段对T细胞进行靶向修饰并同时激活T细胞的嵌合抗原，获得CAR-T细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞(4)将扩增后的CAR-T细胞回输至病人体内，特异性的杀死癌细胞。

自2018年6月中国食品药品检定研究院正式发布了《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》(以下简称《考虑要点》)，其中对慢病毒的转导滴度做出了明确规定。《考虑要点》指出，将病毒载体转导敏感细胞系(如293T细胞、HT-1080细胞等)或原代细胞(如PBMC)后，检测细胞CAR表达阳性率或CAR基因拷贝数，计算其转导滴度(TU/ml)。但由于不同的细胞对病毒载体的敏感性不同，不同的检测参数对病毒载体转导滴度结果也不同，因此，选择何种细胞、检测何种指标进行病毒载体的转导滴度的测定需要进行充分的验证，同时，鼓励研究者在临床试验过程，探索病毒载体转导滴度测定结果与转导T细胞所用的病毒量、CAR-T细胞阳性率以及临床有效性之间的关系，以建立最适病毒滴度测定方法及病毒载体转导剂量。因此，有必要建立一种慢病毒转导滴度测定方法，其结果与转导T细胞所用的病毒量、CAR-T细胞阳性率之间具有较高的一致性，并且操作流程简单。

生物行业内测定慢病毒的转导滴度主要通过人胚胎肾细胞株293细胞进行，其主要步骤：(1)提前一天将293细胞消化、收集、计数、铺板；(2)在转染当天将病毒样品按照一定比例稀释，转染贴壁的293细胞，空白孔进行消化计数，用于转导滴度的计算；(3)转染后24h，进行补液；(4)转染后68-72h消化收集细胞进行流式检测。293细胞是一种贴壁细胞，不仅细胞处理较悬浮细胞繁琐，而且整个检测周期为5天，一定程度上降低了检测的效率。

K562是一种人类髓性白血病细胞，细胞悬浮生长，培养流程简单，主要应用于研究肿瘤和白血病治疗、药物靶标领域。目前尚未有将其用于慢病毒转导滴度测定的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种慢病毒转导滴度的测定方法。

第一方面，本发明要求保护K562细胞在测定慢病毒转导滴度中的应用。

第二方面，本发明要求保护一种测定慢病毒转导滴度的方法。