[发明专利]一种可识别肠癌细胞的树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法

权利要求书

1.一种可识别肠癌细胞树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法，其特征在于，包括：

步骤一、以树舌灵芝发酵浸膏、水和乙醇为原料制备树舌灵芝发酵粗多糖，并向所述树舌灵芝发酵粗多糖中加入水，配制成质量体积浓度5％的树舌灵芝发酵粗多糖溶液；

步骤二、向所述树舌灵芝发酵粗多糖溶液中加入氯仿与正丁醇的混合溶液，并进行浓缩干燥，得到树舌灵芝发酵除蛋白多糖；

步骤三、将所述树舌灵芝发酵除蛋白多糖制备成浓度为10g/L的树舌灵芝发酵除蛋白多糖溶液，并采用离子交换柱层析方法进行生物大分子分离、纯化得到电荷均一的树舌灵芝发酵除蛋白多糖溶液；

步骤四、以蒸馏水为洗脱剂，以1mL/min的流速洗脱，对所述纯化后的树舌灵芝发酵除蛋白多糖溶液进行洗脱，每5分钟收集1管，总洗脱体积为V₁，并将第21～35管合并，冷冻干燥，得到树舌灵芝发酵中性多糖；

步骤五、向所述树舌灵芝发酵中性多糖中加入NaCl溶液，使树舌灵芝发酵中性多糖完全溶解；

并利用凝胶柱层析进行树舌灵芝发酵中性多糖的分子量均一化，获得树舌灵芝发酵中性均一化多糖溶液；

其中，每10mg树舌灵芝发酵中性多糖中加入2mL的摩尔浓度为0.15mol/L的NaCl溶液；

步骤六、以0.15mol/L NaCl溶液为洗脱液，以4mL/15min的洗脱流速，对所述树舌灵芝发酵中性均一化多糖溶液进行洗脱，每4mL收集1管，总洗脱体积为V₂，合并第21～35管洗脱液，冷冻干燥后得到可与肠癌细胞识别的树舌灵芝发酵中性杂多糖。

2.根据权利要求1所述的可识别肠癌细胞树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法，其特征在于，所述树舌灵芝发酵浸膏的相对密度为1.4。

3.根据权利要求1所述的可识别肠癌细胞树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法，其特征在于，所述步骤一中树舌灵芝发酵粗多糖的制备过程为：

步骤1、将树舌灵芝发酵浸膏浸泡在94％～96％的乙醇溶液中得到树舌灵芝发酵浸膏溶解液；其中，浸泡温度为：3℃～6℃，浸泡时间为10～14小时；

步骤2、在所述树舌灵芝发酵浸膏中加入3～6倍体积的水溶解沉淀后，以3000r/min～3200r/min的转速进行离心后过滤得到过滤后的树舌灵芝发酵浸膏溶解液，其中，离心时间为15min；

步骤3、将所述过滤后的树舌灵芝发酵浸膏溶解液70℃温度下水浴提取3h，进行第二次离心处理，提取上层清液，并收集沉淀，对收集的沉淀部分进行70℃温度下水浴提取3h，并进行离心处理，再次提取上层清液，再次收集沉淀，对再次收集的沉淀进行70℃温度下水浴提取3h和离心处理，沉淀后第三次收集上层清液；

将三次提取的上层清液混合，制备成提取液，并对提取液进行减压浓缩，制备成相对密度为1.3～1.5的浓缩液；

步骤4、在浓缩液中加入95％乙醇至溶液中乙醇终浓度为70％为止，在4℃冰箱中静置12小时，3000r/m离心15min收集沉淀，得到为树舌灵芝发酵粗多糖。

4.根据权利要求1或3所述的可识别肠癌细胞的树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法，其特征在于，所述步骤二中树舌灵芝发酵除蛋白多糖的制备过程为：

步骤a、向所述树舌灵芝发酵粗多糖溶液中加入氯仿与正丁醇的混合溶液经磁力搅拌30min后得到混合多糖溶液；

其中，所述树舌灵芝发酵粗多糖溶液中备的多糖溶液与所述混合溶液的体积比为5:1，所述氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

步骤b、对所述混合多糖溶液进行第一次离心处理，收集上层溶液，并对剩余多糖溶液进行第二次离心处理，收集上层溶液，然后，对剩余多糖溶液进行第三次离心处理，收集上层溶液；

将三次离心处理得到的上层溶液混合得到去除蛋白后的多糖溶液；

步骤c、将所述去除蛋白后的多糖溶液减压浓缩至原有体积的1/4，冷冻干燥后得到的树舌灵芝发酵除蛋白多糖干粉。

5.根据权利要求1所述的可识别肠癌细胞的树舌灵芝发酵中性杂多糖制备方法，其特征在于，所述步骤三中的层析柱采用DEAE52纤维素离子交换柱。