[发明专利]一种检测人TERT基因启动子热点突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人TERT基因启动子热点突变的试剂盒，其特征在于：包括针对TERT基因启动子‑124（C/T）和‑146（C/T）突变位点检测的DNA富集常规PCR预混试剂、‑124（C/T）和‑146（C/T）突变质粒和人外周血野生型DNA标准品以及‑124（C/T）和‑146（C/T）突变率检测qPCR预混试剂。本发明试剂盒采用临床常规开展的荧光定量PCR技术平台，针对各种来源的DNA标本进行检测，试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、准确定量检测突变率、费用低廉、并适合临床常规开展等特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种检测人TERT基因启动子热点突变-146(C/T)和-124(C/T)的标本富集、标准品配制和标本校准、以及突变率检测的实时荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒。

背景技术

端粒(telomere)指的是染色体末端含有简单重复5′-TTAGGG-3′碱基系列的DNA和相关蛋白质组成的独特结构，存在于真核细胞中，主要功能是维持染色体结构完整和基因组的稳定性，每一个细胞分裂周期，端粒DNA就会减少，端粒长度进行性缩短，最终导致细胞分裂的停止，迫使细胞衰老及死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶，主要由端粒酶 RNA模版(hTR)、端粒酶逆转录酶(TERT)和端粒酶相关蛋白构成。端粒酶的活化是端粒长度维持或延长的主要机制，而TERT表达上调则被认为是端粒酶活化及活性增强的主要原因之一。

2013年科学杂志首次报道了在黑色素瘤家系和患者中检测到 TERT启动子区域-124(C/T或C/A)、-146(C/T)高突变率(合计突变率>70％)，其中-124(C/T)是主要突变类型，其次是-146(C/T)突变，-124(C/A)突变极为少见。突变可形成TTCCGG/ATCCGG序列，该序列为Ets/TCF转录因子结合位点，导致TERT基因转录活性增加2 至4倍。该热点突变主要出现在自我更新率较低组织来源的肿瘤，主要包括多形性胶质母细胞瘤为80-90％，肝细胞癌60％，膀胱癌60％，基底细胞癌70％，皮肤鳞状细胞癌50％和高达30％的甲状腺癌，并且与甲状腺癌，胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤和肾细胞癌的侵袭性有关，该热点突变的检测对上述肿瘤的诊断、疗效监测、预后判断具有重要的临床应用价值。特别是在原发性肝细胞癌的进展过程中，TERT该热点突变是肝细胞癌最早的体细胞遗传改变，其在肝硬化不良结节中的突变率为6％-19％，并且是肝细胞癌时多个关键信号通路基因突变中唯一的始动突变驱动基因，在向肝细胞癌转化序列中表现为“看门人”的关键步骤，而在早期肝细胞癌中的突变显着增加(61％)并且在进展和晚期肝细胞癌中保持稳定，因此，该突变更有可能成为肝硬化早期癌变监测靶点。

来源于人体各种标本皆可用于基因体细胞突变检测，但标本来源不同所能获取的DNA浓度差异较大，在低浓度标本中进一步检测目标 DNA中某类体细胞突变则需要极其灵敏的检测方法，通常不同的检测方法需要针对特定的标本进行检测。例如新鲜组织、外周血中DNA提取的DNA浓度高，而蜡块包埋组织、各种体液、血浆游离DNA则浓度极低，因此，急需开发适用于各种标本来源的检测试剂盒。

由于TERT启动子区-124(C/T)和-146(C/T)突变周围的DNA序列富含GC(大约80％)，以及这2个突变位点周围的序列几乎彼此相同，这些因素增加了特异性引物和探针的设计和筛选难度，对建立检测方法带来了极大的挑战。目前，针对TERT该热点突变率检测，公开文献报道的有NGS方法(检测下限为0.1％左右)和ddPCR方法(检测下限为 0.1％-0.05％左右)，这2种方法皆存在操作复杂、检测费用高、检测设备昂贵等不适用临床常规开展等问题。

发明内容

本发明就是为了解决上述技术问题，所提供了一种检测人TERT基因启动子热点突变的试剂盒。

本发明是按照以下技术方案实现的。