[发明专利]一种原代肿瘤细胞的3D培养体系及其培养方法和应用

权利要求书

1.一种原代肿瘤细胞的3D培养体系，其特征在于，包括下层凝胶、中层细胞基质和上层培养基；

所述中层细胞基质包含改良的琼脂糖胶、含有添加因子的条件培养基和肿瘤细胞，所述改良的琼脂糖胶中包含低熔点琼脂糖、多聚赖氨酸和细胞外基质；所述细胞外基质为胶原蛋白、层粘连蛋白和透明质酸的组合；

所述胶原蛋白在改良的琼脂糖胶中的浓度为10~100U/mL；

所述层粘连蛋白在改良的琼脂糖胶中的浓度为10~20μg/mL；

所述透明质酸在改良的琼脂糖胶中的浓度为10~100U/mL；

所述多聚赖氨酸在改良的琼脂糖胶中的浓度为0.1~1mg/L；

所述改良的琼脂糖胶中低熔点琼脂糖的质量浓度为0.1~0.4%；

所述下层凝胶包含琼脂糖胶和条件培养基；

所述上层培养基为含有添加因子的条件培养基；

所述条件培养基为：将J2细胞用F-培养基培养3天后收集的培养上清与新鲜的F-培养基按照体积比为3:1的比例进行混合后并添加ROCK1抑制剂Y-27632后为最终的条件培养基；

所述F-培养基为：将Ham's F-12培养基和完全DMEM培养基按照体积比为3:1的比例进行混合，并添加谷氨酰胺、青霉素、链霉素、胎牛血清、氢化可的松、胰岛素、霍乱毒素、表皮生长因子、腺嘌呤和Y-27632 Rock抑制剂；

所述含有添加因子的条件培养基为：向所述条件培养基加入添加因子，所述添加因子包括：L-谷氨酰胺、bFGF、β-巯基乙醇、转铁蛋白和抗坏血酸。

2.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。

3.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述中层细胞基质中肿瘤细胞的接种密度为(1~2)×10⁵/mL。

4.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述下层凝胶的琼脂糖胶中低熔点琼脂糖的质量浓度为0.4~0.8%。

5.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述L-谷氨酰胺在条件培养基中的摩尔浓度为20~100μM。

6.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述bFGF在条件培养基中浓度为10~100ng/mL。

7.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述β-巯基乙醇在条件培养基中的浓度为0.05~0.15mM。

8.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述抗坏血酸在条件培养基中的浓度为40~80μg/mL。

9.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述转铁蛋白在条件培养基中的浓度为5~20μg/mL。

10.根据权利要求1所述的3D培养体系，其特征在于，所述肿瘤细胞的分离培养方法为：

从肿瘤患者的肿瘤组织或胸腹水中收集得到原代肿瘤单细胞或细胞微球，利用条件重编程培养方法扩增培养收集得到所述肿瘤细胞。

11.根据权利要求10所述的3D培养体系，其特征在于，所述收集的步骤包括消化和分离。

12.根据权利要求11所述的3D培养体系，其特征在于，所述消化使用的消化液包括胶原蛋白酶、中性分散酶、脱氧核糖核酸酶或透明质酸酶中任意一种或两种以上的组合。

13.根据权利要求12所述的3D培养体系，其特征在于，所述胶原蛋白酶在消化液中的浓度为100~200U/mL。

14.根据权利要求12所述的3D培养体系，其特征在于，所述中性分散酶在消化液中的为0.6~2.4U/mL。