[发明专利]一种原代肿瘤细胞的3D培养体系及其培养方法和应用

说明书

本发明提供了一种原代肿瘤细胞的3D培养体系及其应用，所述3D培养体系包括下层凝胶、中层细胞基质和上层培养基；所述中层细胞基质包含改良的琼脂糖胶、含有添加因子的条件培养基和肿瘤细胞，所述改良的琼脂糖胶中包含低熔点琼脂糖、多聚赖氨酸和细胞外基质；所述下层凝胶包含琼脂糖胶和条件培养基；所述上层培养基为含有添加因子的条件培养基。本发明提供的3D培养体系，能够筛选肿瘤细胞和正常上皮细胞，同时实现肿瘤细胞优势生长，培养成功率高，能够更加真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性，精确地代表体内肿瘤的生长状况，将其应用于药敏检测所得到结果可靠性高，利于临床推广。

技术领域

本发明涉及肿瘤个体化用药功能药敏检测领域，具体涉及原代肿瘤细胞3D培养方法，尤其涉及一种原代肿瘤细胞的3D培养体系及其培养方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是一类发病率和死亡率都非常高的疾病，严重危害着人类的生命和健康，是导致残疾和早亡的主要疾病之一，在35～59岁年龄组中，恶性肿瘤居死因第一位。目前恶性肿瘤的治疗包括手术，放疗，化疗，内分泌治疗和免疫治疗。

化疗作为一种全身性的治疗手段，因能广泛的杀灭患者体内的肿瘤细胞，提高患者的生存率和生存期，而在治疗中占有非常重要的地位。虽然化疗在肿瘤中占有非常重要的地位，但化疗常因伴有明显的毒副反应和副作用，而且化疗对于多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。其中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见因素，也是困扰肿瘤治疗的关键性难题。

肿瘤是一个异质性、多形态、分化程度不等的细胞群体。肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异。即不同的肿瘤类型或同一类型的不同病人，甚至同一病人在不同的发病阶段，对化疗的敏感性并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种化疗药物或几种化疗药物的联合应用，能对某一种肿瘤100％有效。目前常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性低于50％，约20％～35％的患者接受了不恰当的药物治疗。

为此，建立一种像细菌敏感试验一样，通过相对可靠的敏感试验方法，对不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药，大大提高疗效，避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。

肿瘤药敏检测属于精准诊断范畴，美国肿瘤学会就2004年之前发表的关于肿瘤药物敏感试验和耐药试验的论文进行了比较分析，认为药敏试验的应用对实现化疗药物/方案个体化具有积极的作用。肿瘤药敏试验与患者的遗传背景的分子检测相结合应用于临床肿瘤治疗，对提高靶向药物疗效，降低昂贵的靶向药物费用支出具有重要意义，但现有的肿瘤药敏检测技术均难以实现广泛的临床应用推广。

目前肿瘤药敏试验主要有以下三类：体内药敏检测技术、基于CRC条件重编程培养的2D体外药敏检测和常规的3D药敏检测技术。体内药敏检测技术通过动物实验进行，其优势在于能够保持人肿瘤原有的组织形态和生物学特性、药敏检测准确性均达90％；然而由于动物实验受到体内多种不可控因素的制约，接种成功率低、周期长达3-4个月，同时体内和体外环境相互影响，不利于探究具体机制，且动物实验还具有要求较高、费用昂贵、操作复杂等缺陷。基于CRC条件重编程培养的2D体外药敏检测技术虽然培养成功率高、成本低、操作简单且周期较短，但是该2D体外培养时肿瘤上皮和正常上皮细胞混合扩增，导致基于CRC方法的2D药敏结果不稳定、临床符合率低。常规的3D药敏检测技术成本低，能够模拟体内实体瘤环境，但是由于获得的原代肿瘤细胞少，肿瘤微球培养成功率低，而且不能区分肿瘤细胞和正常细胞、周期较长、难于大规模推广。

目前，3D药敏检测技术基于3D细胞培养(Three dimensional cell culture)技术，3D细胞培养主要包括悬滴培养、水凝胶培养、Matrigel培养，常规低熔点琼脂培养。3D细胞培养既能保留天然细胞微环境的物质结构基础，又能更好的模拟体内细胞生长的微环境，为细胞水平的研究提供了一种更简单、更安全、更可靠的方法。然而，悬滴培养、水凝胶培养和Matrigel培养都不能实现筛选肿瘤细胞和正常上皮细胞的功能。