[发明专利]一种基于无序蛋白偶联酶的高效多肽-多肽偶联系统和方法

说明书

本发明公布了一种基于无序蛋白偶联酶的高效多肽‑多肽偶联系统和方法。通过设计拆分蛋白质结构域CnaB2并进行优化，得到三组分体系：谍标签(SpyTag)、BD标签(BDTag)和谍订书机酶(SpyStapler)，使得SpyStapler可以催化SpyTag与BDTag之间的偶联反应，并制备含有SpyTag和BDTag两个标签的不同的融合蛋白质并进行偶联或环化反应。基于本发明的多肽‑多肽偶联系统，可以利用基因编码的方式获得纯度高且功能稳定的活性蛋白质；谍订书机酶偶联谍标签和BD标签反应效率高，且反应后部分谍订书机酶脱落，得到的环化产物的偶联部分分子量较小。本发明的蛋白质标签适用于多种功能蛋白质及可以融合表达于蛋白质的任意位置。

技术领域

本发明涉及多肽的偶联技术，特别涉及一种基于无序蛋白偶联酶的多肽-多肽偶联体系，以及基于该体系对蛋白质进行偶联或实现环化的方法。

背景技术

多肽/蛋白质标签被广泛应用在蛋白质纯化、蛋白质拓扑工程、生物影像等领域。探连接酶（SnoopLigase）、内含肽（Intein）、分拣酶（Sortase）、蝶豆粘酶（Butelase 1）和天冬酰胺内肽酶（OaAEP1）等蛋白质工具以其高效性、特异性被认为是非常有效的生物多肽偶联方法。

“分子超级胶水”技术的出现提供了一类新的蛋白质标记策略。谍标签（SpyTag）和谍捕手（SpyCatcher）体系、探标签（SnoopTag）和探捕手（SnoopCatcher）体系以及它们的突变体已经证明了“分子胶水”的特异的亲和标记性质。

目前，基于蛋白质结构拆分得到的蛋白质标记工具很少，研究者拆分蛋白质结构域CnaB2得到谍标签（SpyTag）、K标签（KTag）和谍连接酶（SpyLigase），以及拆分蛋白质结构域RrgA得到小探标签（SnoopTagJr）、狗标签（DogTag）和探连接酶（SnoopLigase）。这两个体系需要添加额外的小分子添加剂N-氧化三甲胺（TMAO）或甘油，而且其连接酶的连接效率并不高。目前，特别需要发展高效的基于蛋白质的多肽-多肽偶联酶，特别是那些无需添加剂的高效连接酶体系。

发明内容

本发明基于蛋白质结构域CnaB2进行拆分，得到三组分体系谍标签（SpyTag）、BD标签（BDTag）和谍订书机酶（SpyStapler）。

进行蛋白质拆分时需要注意以下几点：（1）拆分位点需在蛋白质结构域中的柔性链或相对松散的部分；（2）拆分后的多肽或蛋白质重新识别、组装。目前主要有基于结构拆分优化的策略和基于计算模拟拆分优化的策略。对于蛋白质拆分的方法已有诸多报道和不同的应用，如对绿色荧光蛋白质的拆分、对活性蛋白质的拆分等等。这类蛋白质拆分后的基于蛋白质-蛋白质或多肽-蛋白质的相互作用重组并发挥相应的功能。这种策略已经广泛地应用在生物成像领域。然而，针对蛋白质标签的拆分报道较少。近年来发展的一系列生物偶联反应对，如谍标签（SpyTag）、K标签（KTag）和谍连接酶（SpyLigase），以及拆分蛋白质结构域RrgA得到小探标签（SnoopTagJr）、狗标签（DogTag）和探连接酶（SnoopLigase）等等。这类标签一般是长度为二十个氨基酸以内的短肽，连接酶部分则是二十个氨基酸以上分子量较大的蛋白质。这类标签能够与不同的蛋白质融合表达，环化活性蛋白质或者反应形成具有活性的蛋白质高分子链。如果能够发展一类能在生理条件下高效地反应，并且有胞内反应活性的蛋白质化学反应对，那么就能实现高效的胞内环化反应。

本发明基于蛋白质结构域CnaB2进行蛋白质拆分并进行优化，得到三组分体系的多肽-多肽偶联系统，包括谍标签（SpyTag）、BD标签（BDTag）和谍订书机酶（SpyStapler），使得谍订书机酶（SpyStapler）可以催化谍标签（SpyTag）和BD标签（BDTag）之间的偶联反应，从而可以进行高效的蛋白质链中反应，通过制备含有SpyTag和BDTag两个标签的不同的融合蛋白质，实现胞内或胞外活性蛋白质（如二氢叶酸还原酶）的偶联或环化。