[发明专利]一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，将载基因微生物合成纳泡复合体加入过夜培养的细胞中，并补充含体积百分数1%商用青霉素\链霉素双抗溶液的无血清细胞培养基，培养基量在维持细胞基本营养的前提下应该尽量少加，置于37度、体积分数5% CO₂的细胞培养箱中共孵育6-8h，之后充分洗涤并更换为普通完全培养基，即制成超声介导下的生物纳泡-细胞基因转染体系；

所述载基因微生物合成纳泡复合体包括微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒和质粒DNA；所述载基因微生物合成纳泡复合体由阳离子小分子聚乙烯亚胺将带负电荷的微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒与质粒DNA连接起来形成。

2.根据权利要求1所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为25k。

3.根据权利要求1所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，所述蛋白质外壳包被的纳米气泡的制备方法为：

1）产纳泡微生物的培养：取冻存的适量微生物原液加入已高温高压消毒的微生物培养基中，无菌培养摇床37-42度、130-150rpm条件下，培养至培养液变为粉白色；

2）产纳泡优势微生物的筛选：将1）中培养的微生物倒入分液漏斗中，室温下静置直到瓶中液体上层可见一层环状浮游微生物层，从分液漏斗中分离出上层优势浮游生物层及下层培养液；

3）微生物合成纳米气泡的提取纯化：向筛选出的上层优势浮游生物中加入其等体积-2倍体积的TMC裂解液充分混匀，混匀后，于4-8度300g离心3-4h，离心后去除中下层物质；在剩余的上层漂浮物中加入其等体积-2倍体积的PBS缓冲液，继续用上述离心条件离心，重复去除下层溶液、补入PBS缓冲液、离心的步骤，并且每次离心逐渐降低离心转速及时间，直至上层漂浮微生物完全裂解为乳白色GVs，离心管下层溶液完全呈澄清无色透明为止；所述TMC裂解液为10 mmol/L Tris-HCl，2.5 mmol/L MgCl₂和2mmol/L CaCl₂，pH 7.0-7.8；

其中最后一次离心提取纯化前将补充的PBS缓冲液换为含体积百分数10-20%商用青霉素/链霉素双抗的PBS缓冲液。

4.根据权利要求3所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，使用封口膜代替离心管盖进行密封。

5.根据权利要求1所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，所述微生物为细胞内含有纳米气泡结构的浮游微生物。

6.根据权利要求5所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，所述微生物为古细菌嗜盐杆菌、水华鱼腥藻或微囊藻。

7.根据权利要求3所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，其特征在于，所述载基因微生物合成纳泡复合体的制备方法，包括以下步骤：

1）将权利要求3中制备好的已抗菌微生物合成纳米气泡下层的澄清溶液去除，直至纳泡浓度OD500=1.0-2.0；

2）将1-10mg/ml的PEI水溶液与1）中得到的抗菌微生物合成纳米气泡按照体积比1:1-2:1混匀，置于37度环境下静置孵育30-40min后，于室温150g-200g低速离心30-45min直至将溶液彻底分为上层被阳离子化的纳米气泡及下层含游离PEI的澄清溶液，去除下层含游离PEI的澄清溶液；其中PEI水溶液的PH=7；

3）向阳离子化的纳米气泡中加入适量质粒DNA并混匀，质粒与2）中加入的PEI小分子的质量比为1:2-3，置于37度环境下静置孵育15-30min，即制成载基因微生物合成纳泡复合体。