[发明专利]一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡‑细胞体系及其制备方法和应用，其由阳离子小分子聚乙烯亚胺将带负电荷的微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒与质粒DNA连接起来形成载基因微生物合成纳泡复合体，然后将上述载基因微生物合成纳泡复合体与细胞共孵育后粘附在细胞表面，被细胞主动吞噬入胞，制成生物纳泡‑细胞基因转染体系。以超声辐照该细胞体系，激发细胞内空化效应的方式来启动转染，让声孔效应直接在细胞内发生，在细胞核膜表面形成小孔，把纳米气泡携带的外源性基因直接递送至细胞核中，减少被溶酶体等的灭活，从而提高基因递送效率及表达量。

技术领域

本发明涉及细胞基因转染领域，具体涉及一种低频超声介导细胞内空化效应进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用。

背景技术

细胞基因转染技术是采用一定的方法和途径将外源分子如DNA、RNA等导入特定的细胞，使目的基因在细胞中有效、适度地表达特定功能的蛋白质分子。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞中特定基因的表达来研究基因、基因产物及重组蛋白的功能，甚至以此来达到相应的治疗目的。基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病等，更重要的是，基因治疗可以从疾病产生或病情改善的本源入手，疗效显著且确切。随着临床上基因治疗、功能研究的兴起，基因转染技术的应用越来越广泛，此方面的研究有着广阔的发展前景。

为了更高效地让外源基因在真核细胞中表达，人们一直在研究向细胞内递送质粒DNA的有效途径。理想的细胞转染方法应该具有较高的转染效率，低细胞毒性，对细胞的正常生理特性影响较小，且便于实施及具有较好的可重复性。常用方法有：生物学方法(即以病毒为载体的转染法)、化学方法(磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法)、物理方法(显微注射法、基因枪法、电穿孔法、激光照射法、声孔效应法、磁性纳米颗粒等)。以病毒载体的生物学方法、阳离子脂质体转染和电穿孔等物理方法虽然都有较高的转染效率，但病毒载体安全性较差，脂质体表达率较低、持续时间较短、稳定性欠佳且细胞毒性较高，物理方法对细胞损伤较大等弊端，都不能作为最理想的转染方法。

近年研究发现，超声靶向微泡破坏效应(Ultrasound Targeted MicrobubbleDestruction，UTMD)介导的细胞转染法，即声孔效应(Sonaporation)介导的细胞转染法，为基因治疗的临床应用提供了新的技术可能。其原理是利用含气的超声微泡，在一定能量的声场中，微泡随着声波频率发生压缩和扩张，并伴随着气泡内压力和体积的反复变化，产生空化效应。空化效应的作用机制是在声场与微泡造影剂相互作用下，微泡因急剧压缩、闭合破裂而形成微流、冲击波及射流等激烈过程，使周围组织的细胞膜上出现可逆性或不可逆性小孔，提高了细胞膜通透性，外加微泡破裂产生的冲击力，将外源性基因从微孔道推入细胞中，达到基因递送的目的。这种方法具有细胞毒性低、免疫排斥反应小、可修饰性强等优势，在各种疾病的基因治疗中极有应用前景。Bez等在迷你猪胫骨骨折模型中，在骨折处埋入胶原支架后，用促BMP-6转染，成功的使骨折愈合完全。尽管如此，目前在批准进入临床试验的基因治疗中，病毒型载体促基因转染占75％，其促基因转染效率常在90％以上，而UTMD促基因转染效率不高、不稳定，大部分研究仍处于临床前阶段。因此，探讨如何改善UTMD促基因转染效率仍然是目前研究的重点，而其切入点在于如何使更多的基因被递送至细胞核内，才能使外源基因被更大量转染、表达。而直接使超声介导的空化效应在细胞内产生，增加细胞核膜通透性，促使质粒DNA入核是一种新颖而有效的解决方案。

幸运的是，大量的研究证明：许多真核细胞在体外具有吞噬大量纳米级颗粒的能力。Zhe-Zhen Yu等制作了两种低浓度的氨基酸外壳包被的磁性纳米颗粒，体外成功观察到其被骨髓间充质干细胞(BMSCs)成功吞噬入胞。此前研究较多的纳米级超声颗粒主要包括声学脂质体、氟碳纳米液滴、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等。但上述化学合成纳米气泡都存在着粒径不均一、胞内稳定性差、细胞毒性大等问题，并不适用于细胞吞泡后的基因递送。