[发明专利]紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法

权利要求书

1.紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)菌种培养

将紫色红曲菌M1菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d。

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存。

(二)红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；

2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；

3.加入160μL的无水乙醇，将混合液移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；

4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；

5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；

6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；

8.重复一次步骤7；

9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-Free ddH₂O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；

(三)RNA质量检测

1.利用核酸定量仪进行RNA浓度检测，具体步骤如下：取1μL RNA，点样于检测孔，得到RNA浓度；

2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：

(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取3μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；

(2)电泳仪电压为150V，时间为15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；

(四)cDNA的反转录

(1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；

表gDNA去除反应体系

(2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；

反转录反应体系

(3)取步骤(2)中配制的混合液10μL，加到步骤1的反应体系中，短暂离心；

(4)42℃孵育15min，然后再95℃孵育3min，得到的cDNA溶液于-20℃保存；

(五)引物设计

根据红曲菌comp50904_c0基因序列设计引物；引物及序列如下：

(六)过表达载体构建

以pBC-hygro为过表达载体，选出两个该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp51725_c0目的基因进行连接，构建过表达pBC-hygro-comp51725_c0质粒；

(1)comp51725_c4基因的扩增

根据红曲菌转录组所得comp51725_c0基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌的cDNA为模板进行扩增comp51725_c0基因；comp51725_c0基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

comp51725_c0基因的PCR反应体系

PCR反应体系	体积(μL)
PrimeSTAR Max Premix(2X)	12.5
comp51725_c0-F	1
comp51725_c0-R	1
cDNA	1
2O]]>	9.5
总体积	25

PCR反应条件如下：

1)95℃for 5min；

2)94℃for 30sec；

3)55℃for 30sec；

4)72℃for 10sec；

5)GOTO2，30more times；

6)72℃for 10min；

7)4℃，forever；

(2)PCR产物纯化回收

具体步骤如下：

1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀；(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)；

2.将上述步骤中所得溶液转移到吸附柱AC中，室温静置1min，后12,000rpm离心30-60sec，弃滤液；

3.加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

4.加入500μL漂洗液WB，12,000rpm离心1min，弃废液；

5.空柱离心2min；

6.将吸附柱AC放入新的离心管中，向吸附膜中央滴加40μL提前于65℃水浴中加热的洗脱缓冲液EB，室温静置2min，12,000rpm离心1min；

(3)comp51725_c0基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的双酶切

双酶切体系

酶切反应条件：37℃，2h；将酶切产物纯化回收；

(4)comp51725_c0基因PCR产物与pBC-Hygro质粒的连接

步骤如下：

1.将comp51725_c0片段和pBC-Hygro质粒按3:1的比例制成4.5μL的溶液，置于65℃水浴2-3min，后放冰上备用；

2.向上述混合液中加入4.5μLSolutionI，16℃反应30min；

3.向反应液中加入1μLSolutionII，于-20℃冰箱保存；

(5)重组质粒的转化

1.取5μL连接产物轻柔打入50μL感受态细胞中，用手轻弹混匀，冰浴30min；

2.42℃水浴中热激90sec，立即于冰上冷却5min；

3.加入1mL LB液体培养基，200rpm，37℃振荡培养60min，使菌体复苏；

4.培养后得菌液适当浓缩，取200μL涂布于含34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，200rpm，37℃震荡培养14h后提取重组质粒；

(6)重组质粒验证

1.电泳检测：取5μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶电泳检测；

2.双酶切验证：用QuickCutXbaI和QuickCutClaI对条带大小与预期相符的重组质粒做双酶切验证；若双酶切后的酶切产物有两条条带，条带大小分别与质粒酶切以及目的片段基因酶切后的片段大小相符，则证明重组质粒构建成功；

(七)过表达质粒转化

(1)红曲菌原生质体制备

1.将红曲菌M1接种于4个PDA平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养4d；

2.每个平板上加10mL灭菌水，用接种环轻刮菌体表面，释放出孢子，制备孢子悬液；

3.取200μL孢子悬液，涂布于铺有经灭菌、烘干后的玻璃纸PDA平板上，涂至干涩，30℃培养30-40h；

4.用接种环刮取玻璃纸上的淡粉色菌丝体置于mira cloth单层上，用50mL MgSO₄溶液滤洗；

5.将菌丝体转移至经过滤除菌的50mL裂解酶液中，于30℃，60rpm酶解2.5-3h，然后用mira cloth单层过滤；

6.滤液于4℃，7000rpm离心5min，弃上清；

7.然后用1.2mol/L的山梨醇溶液过滤2次(离心，去上清)，再加入山梨醇溶液重悬原生质体，置于冰上备用；

(2)红曲菌潮霉素耐受浓度筛选

吸取100μL的红曲菌M1感受态细胞悬液涂布于PDA平板，潮霉素B的梯度浓度为：0、5、10、15、20、25μg/mL，于30℃恒温培养，以确定潮霉素B对M1生长的最佳抑制浓度；

(3)原生质体的电击转化

1.将重悬于山梨醇溶液中的原生质体于7000rpm离心5min，尽量吸净上清，加1mL电击转化液，吸打混匀，离心去上清；再加入220μL电击转化液，吸打混匀；

2.取两个灭菌的新1.5mL离心管，各加入70μL电击转化细胞，一管加入1μg质粒，吸打混匀，冰浴15min；

3.将上一步离心管中的溶液全部转移至预冷的电击转化杯中，电击后立即加入900μL预冷的复苏液体培养基，吸打混匀；

4.将电击转化杯中的液体转至1.5mL无菌离心管中，冰浴10min；

5.将离心管放入空培养皿中，于30℃，100rpm培养2h；

6.涂布100μL至PDA平板上，于30℃恒温培养6-7d。