[发明专利]紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法

说明书

本发明公开了紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，包括菌种培养、过表达载体构建、过表达质粒转化等步骤。本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp51725_c0基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBC‑Hygro连接，导入红曲菌M1菌株中，成功构建了过表达工程菌株C6。通过对比过表达comp51725_c0基因的C6菌株和M1菌株的次级代谢产物产量、菌体干重、菌丝体形态等相关生理指标发现，下调基因comp51725_c0基因的过表达会降低红曲菌中Monacolin K的产量，并在一定程度上改变了菌丝体的形态，但对于红曲色素和菌体生物量的影响不大。

技术领域：

本发明涉及一种紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

背景技术：

红曲菌又称“红曲霉”，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌可以产生多种次级代谢产物，如红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素等，其中许多代谢产物被广泛的应用于食品色素、医药、酿酒等方面，Monacolin K又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，Monacolin K具有抑制胆固醇合成中关键酶HMG-CoA活性的作用，能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药。

本发明的申请人实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现了52个转录因子和27个靶基因，对其中的10个转录因子和靶基因进行了基因功能的预测并获得了相关的基因信息。由于红曲菌Monacolin K具体调控机制还未完全清晰，可对上述转录因子和靶基因进行基因克隆、功能验证等工作，以期获得红曲菌次级代谢产物合成过程中关键调控因子。

本发明选取转录组测序所得到的一个下调基因comp51725_c0进行基因克隆，并构建该基因过表达工程菌株，探究目的基因的过表达对红曲菌Monacolin K的合成、红曲色素的合成、菌丝体形态、生物量及相关基因表达量的影响。。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：

(一)菌种培养

将紫色红曲菌M1菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d。

分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存。

(二)红曲菌总RNA的提取

具体步骤如下：

1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；

2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；