[发明专利]一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法

说明书

本发明属于微生物技术领域，具体为一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。本发明方法包括：称取BHI干粉、酵母提取物、葡萄糖；将它们加入水中，搅拌均匀制得BHI Sup.培养基；将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株融化后在血平板上划线种菌，所得菌落接种于布氏琼脂肉汤，用振荡培养箱在厌氧环境下振荡培养；用离心管收集培养出的菌体，离心，弃上清后使用布氏琼脂肉汤重悬菌体；将重悬后的菌体使用BHI Sup.培养基体外培养，得到痤疮丙酸杆菌生物膜。该生物膜的生物量、膜内活菌数量、膜结构均优于现有常规培养基。本发明有效解决了由于痤疮丙酸杆菌生长条件严苛，且生长速率慢，体外构建其生物膜较为困难等问题。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体为一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

背景技术

痤疮丙酸杆菌是一种厌氧的革兰阳性杆菌，主要定植在皮肤毛囊皮脂腺单位，是人体皮肤的共生菌群。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生存方式，有三个关键的组成部分：细菌细胞、供细菌附着的平面，以及细胞外的多糖蛋白复合物。后者由细菌分泌，并能够保护细菌免受宿主免疫反应及局部和系统抗生素治疗的伤害。由于痤疮丙酸杆菌生长缓慢，临床怀疑是痤疮丙酸杆菌引起的严重或深部感染，需延长厌氧培养至14天，且生长所需环境条件严格（微需氧或厌氧），故体外构建其生物膜的难度较大，按照常规生物膜构建方案难以很好地形成生物膜。再加上目前还未有针对痤疮丙酸杆菌特性进行独特设计的培养基，使得痤疮丙酸杆菌的体外培养变得尤为困难。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决采用现有技术对体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜不够理想的问题，提供一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，具体步骤如下：

步骤1：准备原料，称取35-40g的BHI（厌氧脑心浸液）干粉，3-7g的酵母提取物；

步骤2：配置培养基，将35-40g BHI干粉、3-7g酵母提取物溶于0.8-1.2L水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液，混合搅拌均匀，制得培养基，记为BHI Sup.培养基（BHISupplemented培养基），调整培养基pH值为7.0；

步骤3：复苏种菌，将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化，然后在血平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的OD600nm均调整为0.08-0.12，使用振荡培养箱在振荡转速200-300rpm环境下35-38℃厌氧培养110-140h；

步骤4：重悬菌体，使用无菌离心管收集培养出的菌体，采用离心机处理，离心转速4000-6000rpm，时间5-8mi，吸弃上层清液不用，然后使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整OD600nm值至0.9-1.1；

步骤5：菌种培养，将重悬后的菌体以1:100-1:200比例使用BHI Sup.培养基进行稀释，然后加入96孔板（200ul／孔），37℃厌氧培养120h。这一时间只需要5天，远远小于通用方法中的14天。

其中，所述冻存的痤疮丙酸杆菌的菌种取自痤疮患者皮损处，经分离鉴定后获得，保证痤疮丙酸杆菌的纯净。

其中，所述取得的菌种放置在甘油中，于-80℃中保存。

其中，步骤1中所述酵母提取物使用高纯度高蛋白型酵母提取物。

其中，步骤2中所述水为去离子水。

本发明的有益效果是：

1、通过配置的BHI Sup.培养基，并在厌氧环境下进行痤疮丙酸杆菌培养，解决了由于痤疮丙酸杆菌生长条件严苛（厌氧或微需氧），且生长速率慢，现有技术中在体外构建其生物膜较为困难的问题；