[发明专利]一种利用木糖生产乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1‑A6的改造，得到所述重组菌；A1、敲除所述受体菌的核酮糖磷酸异构酶基因；A2、敲除所述受体菌的丙酮酸氧化酶基因；A3、敲除所述受体菌的乙酸激酶基因；A4、增加所述受体菌中木酮糖裂解酶基因编码蛋白质的表达量；A5、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶编码蛋白质的表达量；A6、增加所述受体菌中双功能乙醛乙醇脱氢酶基因编码蛋白质的表达量；所述受体菌为含有所述核酮糖磷酸异构酶基因、所述丙酮酸氧化酶基因基因和所述乙酸激酶基因的细菌或真菌。本发明构建的重组菌能够提高利用木糖产生乙醇的效率。

技术领域

本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，涉及一种生产乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用，更具体地，涉及一种利用木糖生产乙醇的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

木糖(D-xylose)是木聚糖的主要构成单位，在植物体内有大量储存，分子式是C₅H₁₀O₅。木糖分布广泛，主要以聚合体的形式存在。木质纤维素原料中，大约30％的组分由木糖构成，储量非常丰富，是自然界中继葡萄糖之后的第二大糖类物质。木糖在玉米芯中含量较高，利用玉米芯为原料制备木糖工艺较为成熟。

自然界中大部分的微生物可以代谢葡萄糖，但是只有小部分微生物能够代谢木糖。因此与葡萄糖相比，木糖在发酵工业中的应用十分受限。开发高效利用木糖的代谢途径将会对其工业应用产生重要推动作用。自然界中已经发现的木糖代谢途径主要有三条：(1)在大肠杆菌等微生物中，木糖首先由木糖异构酶转化为木酮糖，再在木酮糖激酶的作用下生成木酮糖-5-磷酸，由此进入磷酸戊糖途径分解。(2)在酵母等微生物中，木糖首先被木糖还原酶还原为木糖醇，再经木糖醇脱氢酶氧化为木酮糖，接下来由木酮糖激酶催化生成木酮糖-5-磷酸，进入磷酸戊糖途径分解。(3)新月柄杆菌中，木糖在木糖脱氢酶、木糖酸内酯酶和木糖酸脱水酶的催化下生成2-酮-3-脱氧-木糖酸，再经过脱水、脱氢反应形成α-酮戊二酸，进入三羧酸循环分解。

木糖作为存储量巨大的可再生生物质资源，利用合成生物学与代谢工程技术对微生物进行改造，使其利用木糖为碳源生产高附加值和应用广泛的化学品，具有极其广阔的市场前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，如何进行木糖的高效代谢产生乙醇，并提供一种能够用于木糖代谢产生乙醇的重组菌。

为了解决以上技术问题，本发明提供了能够利用木糖产生乙醇的重组菌的构建方法。

本发明所提供的重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A7的改造，得到所述重组菌；

A1、敲除所述受体菌的核酮糖磷酸异构酶基因或抑制所述核酮糖磷酸异构酶基因的表达或抑制所述核酮糖磷酸异构酶基因编码的蛋白质的活性；

A2、敲除所述受体菌的丙酮酸氧化酶基因或抑制所述丙酮酸氧化酶基因的表达或抑制所述丙酮酸氧化酶基因编码的蛋白质的活性；

A3、敲除所述受体菌的乙酸激酶基因或抑制所述乙酸激酶基因的表达或抑制所述乙酸激酶基因编码的蛋白质的活性；

A4、增加所述受体菌中木酮糖裂解酶基因编码蛋白质的表达量或增强所述木酮糖裂解酶基因编码蛋白质的活性；

A5、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶编码蛋白质的表达量或增强所述磷酸转乙酰酶编码蛋白质的活性；

A6、增加所述受体菌中双功能乙醛乙醇脱氢酶基因编码蛋白质的表达量或增强所述双功能乙醛乙醇脱氢酶基因编码蛋白质的活性；

所述受体菌为含有所述核酮糖磷酸异构酶基因基因、所述丙酮酸氧化酶基因和所述乙酸激酶基因的细菌或真菌。

进一步，所述受体菌为大肠杆菌。

进一步，所述受体菌为大肠杆菌MG1655或大肠杆菌JM109。