[发明专利]抗TNF-α单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及抗TNF‑α单克隆抗体的制备方法，包括亲和层析，病毒灭活，深层过滤，阴离子交换层析，阳离子交换层析等步骤。本发明通过在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，以及在阳离子交换层析淋洗过程中改变缓冲液的pH，提高了产品的纯度，同时得到了较高的总回收率。

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗TNF-α单克隆抗体的制备或纯化方法。

背景技术

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)是一种促炎细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，能促进淋巴细胞的浸润，加速T细胞的活化，其在正常的免疫应答中发挥抗感染和抗损伤的作用。然而，长期高水平的TNF-α与多种自身免疫疾病和炎症性疾的发生密切相关，如类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。TNF-α单克隆抗体能特异性地结合TNF-α，竞争性地阻断TNF-α与其受体结合，阻止其对免疫反应的调控及其对炎症的诱导作用，具有靶向性强、毒副作用低、高效等特点，因此在临床医疗中发挥重要的作用。目前，已有多种TNF-α单克隆抗体药物被批准用于自身免疫和炎症性疾病的治疗，包括英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)。

单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如CHO、BHK细胞等，以确保获得期望的折叠和糖基化，所述基因工程包括将目的基因导入到该细胞系中。哺乳动物细胞培养过程中添加包含氨基酸、盐和生长因子等多种成分的培养基，宿主细胞自身产生的宿主蛋白(Host Cell Protein，HCP)和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂；且单克隆抗体药物的分子量大、结构复杂，给制造工艺带来较大的困难。但为了确保抗体药物对人体的安全性，必须去除生产过程累积的污染物，保证抗体药物达到较高的纯度。抗体药物制造的下游工艺较复杂，任何不完善都可能造成极大的损失，因此建立有效的下游纯化工艺来增加单克隆抗体的产率和纯度是非常必要的。目前下游工艺常用的纯化手段包括亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析等，虽然生产中常采用这些层析方法，但是层析的具体条件、参数、填料选择的差异会产生完全不同的结果。

亲和层析作为单克隆抗体层析分离的重要手段，通常用来捕获细胞培养液中的产品。由于亲和层析材料可特异性吸附抗体，当抗体载量合适时，细胞培养液经过亲和层析后的产品往往可以达到较高的单体纯度，同时还能保证较高的回收率。如果能在亲和层析步骤中尽可能多的除去HCP和核酸等污染物，将会减轻后续色谱层析和深层过滤的压力，进而降低抗体的生产成本。

阳离子交换层析一般用于抗体的精纯，其主要作用是去除聚合物高分子量杂质，同时也能进一步去除HCP和核酸，提高单克隆抗体的纯度。本领域常规的做法是低浓度盐上样后选择适合浓度的盐竞争结合阳离子交换材料，从而将抗体洗脱下来，达到分离目的。对于抗体或抗体药物的分离而言，不仅需要尽可能多的降低HCP、核酸和聚合物高分子量杂质等的含量，还需要对电荷异构体进行分离。然而，常规的阳离子交换层析对于与目的蛋白电荷差异较小的酸碱性类似物的分离效果较差。为了解决上述问题，需要开发新的抗体纯化方法，提高抗体的纯度和质量。

发明内容

一方面本发明的目的包括提供一种可以提高单克隆抗体制品纯度的抗体纯化工艺。

另一方面，本发明的目的还在于提供一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)细胞培养液深层过滤；

(b)亲和层析；

(c)病毒灭活；

(d)二次深层过滤；

(e)阴离子交换层析；

(f)阳离子交换层析；

(g)病毒过滤和/或超滤。