[发明专利]一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种编码乳糖酶的人工合成基因，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组乳糖酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％活性重组乳糖蛋白，该活性蛋白具有很强的水解乳糖活性，将为分解乳制品中的乳糖提供高活力的酶产品。

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

背景技术

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又称乳糖酶缺乏症。母乳和牛乳中的糖类主要是乳糖，小肠尤其是空肠黏膜表面绒毛的顶端乳糖酶的分泌量减少或活性不高就不能完全消化和分解乳汁中乳糖，部分乳糖被结肠菌群酵解成乳酸、氢气、甲烷和二氧化碳。乳酸刺激肠壁，增加肠蠕动而出现腹泻，偶尔还可能诱发肠痉挛出现肠绞痛。乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题，不同国家乳糖不耐受发生的高峰年龄段不同，我国87％的儿童乳糖不耐受发生在7～8岁。

利用外源基因表达系统来生产重组乳糖酶是大量获得乳糖酶的主要技术手段之一。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组乳糖酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合乳糖酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.本发明提供基因，为编码乳糖酶蛋白的基因，为如下(1)-(2)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1638个脱氧核苷酸组成，本序列包括乳糖酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中SEQID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

2.本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的由序列2衍生的蛋白质。