[发明专利]一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法

权利要求书

1.在一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型，受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.2，供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；

（2）IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；

（3）原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞，根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物，流式细胞术分选肝脏固有和浸润肝脏巨噬细胞，并描述其数量、分布和表型。

2.根据权利要求1所述的肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤包括：

a.CD45.1的C57BL/6小鼠骨髓细胞的制备：

处死小鼠并消毒皮肤；

游离出小鼠四肢长骨，浸泡在RPMI-1640中；

剪去两端软骨，冲出骨髓腔内细胞；

反复吹打混匀细胞悬液，收集骨髓细胞悬液并过滤；

收集细胞悬液，250g离心10min，去上清，加红细胞裂解液2ml裂解红细胞，室温静置3min，400g离心5min，去上清；

所获细胞200μlPBS重悬，计数；

b.小鼠骨髓移植模型的建立：

照射移植组小鼠，经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，在异氟烷麻醉下接受静脉注射骨髓细胞；

照射未移植小鼠，不做进一步处理，作为对照；

骨髓移植完毕，于动物中心屏障环境中继续观察，饮用抗生素水一周，后自由饮水，饲标准饮食；不接受骨髓移植的小鼠2周后全部死亡。

3.根据权利要求1所述的肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤包括：

a、C57BL/6小鼠随机分为不接受光照的阴性对照组、照射后24h、48h、7d处理组，每组6只，饲养方式同前，一周后C57BL/6小鼠经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，照射后收集照射24h、48h、7d处理组以及阴性对照组小鼠组织制作石蜡切片；

b、免疫组织化学：

60℃烤片8h；

脱蜡至水：常规二甲苯脱蜡20min×2次，梯度酒精脱水，无水乙醇5min×2次，95%乙醇5min×2次，80%乙醇5min×2次，70%乙醇5min×2次，50%乙醇5min,流水冲洗1min；

抗原修复：将切片浸入装有0.01M 、pH6.0的柠檬酸缓冲液于电热锅中加热至沸腾持续10min，取出自然冷却至室温后用1×PBS冲洗5min×3次；

阻断内源性过氧化物酶：切片在30% H₂O₂甲醇溶液中浸泡10min，后用1×PBS冲洗5min×3次；

每张切片加入按1:100稀释后的一抗100ul，室温孵育1h后4℃过夜；阴性对照的切片则滴加1×PBS，次日取出室温静置1h后用1×PBS冲洗3 min×3次；

每张切片上加相应的二抗室温孵育1h，1×PBS冲洗3 min×3次；

显色：除去PBS，将切片滴加DAB工作液，同时在显微镜下观察控制显色程度，看到抗原明显表达时，则置流水下冲洗及时终止显色；

苏木素复染30s-2min，流水冲洗，1%盐酸-乙醇分化，流水冲洗；

脱水：70%乙醇3min， 80%乙醇3min，95%乙醇3min，无水乙醇3min，二甲苯1 min；

封片：中性树胶封片。

4.根据权利要求1所述的肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤包括：

a.原代肝脏单个核细胞的分离：

处死小鼠并消毒皮肤，固定于鼠板；

于原代培养超净工作台内，打开腹腔，暴露心脏和肝脏，心脏插管；

原位灌流D-Hanks液,灌流50ml液体，至肝脏表面变白，离体肝脏；将肝脏放入含青-链霉素的1×PBS液中清洗2次，放入无菌烧杯中；

于小烧杯中剪碎肝脏，37℃水浴中继以含有胶原酶以及Dnase的消化液消化35min；

细胞悬液经200目滤网过滤；

滤液均匀分至离心管中，4℃离心47g，5min.吸取上清至新的离心管；

400g离心8min,弃上清留沉淀；细胞沉淀加10ml 1×PBS 重悬，重复离心一次；

细胞沉淀以25%percoll、50% percoll梯度密度离心，4℃，400g，30min；

吸取50%、25% percoll间的悬浮细胞至新的离心管中，加1×PBS液8ml重悬，经4℃、400g离心8min，弃上清留取沉淀，如此重复一次；所得沉淀加200ul 1×PBS重悬后计数；

b.流式细胞分选：

细胞以适量CSB重悬，加入CD16/32抗体，冰上封闭5-10min；

加入10ul的流式分选对应抗体，4℃避光孵育20min；

加入红细胞裂解液1ml 室温孵育5min ，350g 离心5min，弃上清；

沉淀以0.5ml Cell Staining Buffer重悬，加入7-AAD，避光孵育3-5min；经流式分选仪分选；

c、流式细胞仪检测的细胞表面标志表示：骨髓移植小鼠肝脏中F4/80和CD11b 阳性单核巨噬细胞中约28.7%为来自受体的CD45.2阳性固有巨噬细胞，67.5%为来自供体的CD45.1阳性单核巨噬细胞。