[发明专利]一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法

说明书

本发明提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，包括如下步骤：（1）建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型，受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.2，供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；（2）IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；（3）原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞，根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物，流式细胞术分选肝脏固有和浸润巨噬细胞，并描述其数量、分布和表型。本发明通过照射去除CD45.2受体小鼠骨髓来源巨噬细胞，并以CD45.1供体小鼠骨髓补充替代受体小鼠骨髓细胞。从而保证骨髓来源的浸润巨噬细胞细胞和固有巨噬细胞具有不同的分子表型，达到准确高效分离肝脏不同来源巨噬细胞的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法。

背景技术

肝脏不仅是重要的物质代谢场所，也是重要的免疫器官。肝脏巨噬细胞由固有和浸润巨噬细胞共同组成，表型和功能复杂，在维持肝脏正常生理功能以及各种毒物、药物和病原微生物引起的肝脏损伤以及各种肝脏代谢性疾病中发挥着重要作用，始终是肝脏病理研究的一个重要领域。

肝脏固有巨噬细胞与来源于外周血单核细胞的浸润巨噬细胞是具有不同起源和不同生物学功能的细胞群体。近年来研究表面肝脏损伤早期固有巨噬细胞数量减少，之后通过自身增殖补充，这种增殖与趋化到局部的外周血单核来源巨噬细胞无关。2014年，Zigmond等在急性肝损伤模型中，再次证实浸润的外周血单核细胞不参与损伤过程中肝脏固有巨噬细胞的补充，后者可自我更新。在肝脏损伤过程中，肝脏浸润巨噬细胞和固有巨噬细胞各自的作用尚不清楚，但是到目前还缺乏能有效区分肝脏浸润和固有巨噬细胞的表面标志物。现有方法多根据单核巨噬细胞表面标志物 F4/80和CD11b 表达的高低来区分不同来源肝脏巨噬细胞，但巨噬细胞是一个复杂的群体，浸润和固有巨噬细胞中可能同时存在F4/80和CD11b高表达或低表达的细胞，因此这两种标志物不能准确区分巨噬细胞来源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，有助于区分不同来源巨噬细胞，进而研究它们在肝脏局部损伤修复及免疫调控中作用的认识，为深入解析肝脏巨噬细胞在多种肝脏病理过程中的作用提供基础。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型，受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.2，供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；

（2）IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；

（3）原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞，根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物，流式细胞术分选肝脏固有和浸润肝脏巨噬细胞，并描述其数量、分布和表型。

其中，步骤（1）的具体步骤包括：

a.CD45.1的C57BL/6小鼠骨髓细胞的制备：

处死小鼠并消毒皮肤；

游离出小鼠四肢长骨，浸泡在RPMI-1640中；

剪去两端软骨，冲出骨髓腔内细胞；

反复吹打混匀细胞悬液，收集骨髓细胞悬液并过滤；

收集细胞悬液，250g离心10min，去上清，加红细胞裂解液2ml裂解红细胞，室温静置3min，400g离心5min，去上清；

所获细胞200μlPBS重悬，计数；

b.小鼠骨髓移植模型的建立：

照射移植组小鼠，经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，在异氟烷麻醉下接受静脉注射骨髓细胞；