[发明专利]一种链式NK细胞的培养方法

说明书

本发明公开一种链式NK细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：培养NK细胞前，先提前用单克隆抗体CD56、CD16，以及细胞因子IL‑21、IL‑15包被培养瓶/皿，培养当天收集人外周血、脐血、骨髓等来源的单个核细胞，采用自体细胞饲养层与因子组合2步链式激活，以后根据细胞生长情况及时补液并于第5天添加因子组合再次激活。本发明在前5天内期可以获得高基数活化的高表达CD3—CD56+的NK细胞，通过14天的扩增培养可以获得大量高纯度的自然杀伤NK细胞，能够满足临床治疗肿瘤的需求。

技术领域

本发明涉及一种一种链式NK细胞的扩增培养方法，属于细胞生物学领域。

背景技术

NK细胞即自然杀伤细，主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，主要存在于外周血，占外周血淋巴细胞的5%-15%，NK细胞的表型为CD3-CD56+。NK细胞是人体固有免疫系统的重要效应细胞，具有抗肿瘤和抗病毒的作用；不紧对血液肿瘤具有杀伤作用，同时对实体肿瘤也具有一定得作用。相比于T细胞，纯度高的NK细胞一般不会引起移植物物抗宿主病（GVHD），因而成为肿瘤治疗的候选细胞之一。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多，导致对NK细胞的需求也越来越大。

目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法:①采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞；②是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；③单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。

本实验采用因子培养法，独特之处是我们采用因子包被的方法，两步链式刺激，再结合细胞因子组合的扩增法。

发明内容

一种链式NK细胞的培养方法的操作步骤如下：

抗体的包被：分别将CD56单抗、CD16单抗、IL-21因子、IL-15因子溶于5～12毫升的DPBS中充分溶解得到包被液，然后加入到底面积为T75cm²的培养瓶中，4℃避光4～24小时或者室温避光2～4个小时或者37℃避光0.5～1个小时。包被浓度为：CD56单抗1～10ug/ml ；CD16单抗1～10ug/ml；IL-21因子1～100ng/ml；IL-15因子1～100ng/ml。

单个核细胞（PBMC）的分离：人脐带血或者外周血单个核细胞（PBMC）和血浆分离后，血浆56℃灭活30分钟后离心，取上层血清加入到无血清培养基中，同时加入IL-2，配成含血清10%、IL-2终浓度为300～1000IU/ml的完全培养基。PBMC用上述培养基重悬平均分成A和B两等份，每份5～20ml，最终控制细胞细胞浓度0.5～3×10⁶/ml。

第1步激活培养：取上面包被的培养瓶，倒掉包被液，用DPBS缓冲液冲洗2遍后，加入A细胞，放入37℃、5%CO2培养箱。

因子组合刺激培养：培养3h后，取出3）培养瓶，添加细胞因子IL-21和IL-15，IL-21终浓度为1～100ng/ml，IL-15 终浓度1～100ng/ml。混匀继续培养。

第2步激活培养：培养3h后，取出4）培养瓶,吹打混匀，把另一份B细胞吹打混匀后加入上述培养瓶中，混匀继续培养。

扩大培养：隔天观察细胞状态并计数，及时添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x10⁶/ml。当培养基超过60ml时转入透气的GT-T610细胞培养袋，继续培养。

第5天时：观察细胞状态并计数，添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x10⁶/ml。同时添加因子IL-15,终浓度为1～100ng/ml，添加因子IL-21,终浓度为1～100ng/ml继续培养。以后隔天观察细胞生长状态并取样计数，添加GT-T551完全培养基，保持细胞浓度为1x10⁶/ml继续培养。

4天细胞时：取1毫升的细胞悬液进行细胞计数和流式检测CD3 -CD56+含量，计算NK细胞的增殖倍数和纯度。