[发明专利]检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法

权利要求书

1.一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(1)将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶样品；

(2)将固定后的黑茶样品进行分散处理、过滤，加入琼脂糖保护，封膜后得到第一滤膜；

(3)杂交缓冲液和合成HRP的寡核苷酸探针以300:1混合，得到第一混合液，将所述第一混合液和第一滤膜混合后孵育，离心得到第二滤膜；

(4)酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将所述第二混合液和第二滤膜混合进行信号放大，冲洗后制成玻片标本；

(5)使用荧光显微镜检测、拍照并统计，计算得到黑茶中微生物的数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞固定的过程为：将黑茶离心，加入甲醛溶液振荡后，在4℃下冷却4h，离心；之后加入1:1磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，振荡混匀。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述第一滤膜的制备过程为：将固定后的黑茶加入1:1的磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，进行分散处理，稀释于10mL的去离子水中，用0.2um的滤膜进行过滤，标记好滤膜有微生物的一面，加入0.1％的琼脂糖到滤膜有微生物的一面进行封膜，之后在37-46℃下，干燥15min；破壁处理后使用HCl灭火内源酶；之后进行冲洗。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，第二滤膜的制备过程为：将之前处理好的滤膜剪切成小块。杂交缓冲液与HRP标记的寡核苷酸探针以300:1比例充分混合。将剪碎的滤膜放入1.5mL离心管中，然后加入杂交缓冲液和探针的混合液300uL。在46℃条件下，10rpm摇床条件下孵育一定时间。杂交完成，在48℃条件下，在50mL离心管中使用冲洗缓冲液冲洗15min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)的具体过程为：将第二滤膜放入磷酸缓冲盐溶液中冲洗，将1份酪胺标记的荧光染料、500-2000份信号增强缓冲液和0.0015％双氧水混合，得到第二混合液，将冲洗后的第二滤膜放入第二混合液中，46℃黑暗条件下处理20-60min，进行信号放大，之后用乙醇进行冲洗；滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料溶液，之后采用乙醇进行冲洗。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)的具体过程为：使用倒置荧光显微镜观测样品，随机挑取10个视野拍照；使用图像处理软件或人工计数对拍摄的照片进行微生物计数，最后换算成每克茶样中所含微生物的数量。