[发明专利]检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法

说明书

本发明提供了一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其包括：将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶；将固定后的黑茶进行超声、过滤，加入琼脂糖，封膜后得到第一滤膜；杂交缓冲液和寡核苷酸探针混合，得到第一混合液，将第一混合液和第一滤膜混合并离心，得到第二滤膜；酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将第二混合液和第二滤膜进行处理，计算得到黑茶中微生物的数量；本发明使用辣根过氧化物酶标记寡核苷酸分子，通过酶活反应将荧光分子大量结合到目标DNA周围，大幅度提高了检测灵敏度，对一些丰度很低且存在风险的微生物，能够快速检出，保证了黑茶生产过程中的安全性，并降低了背景荧光。

技术领域

本发明属于食品科学与工程技术领域，涉及一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，更具体涉及到黑茶发酵过程中微生物群落结构和数量的分析检测，是一种基于酶联荧光原位杂交的检测发酵样品中霉菌、酵母、细菌等丰度的方法。

背景技术

黑茶属于六大茶类之一，属后发酵茶；因成品茶的外观呈黑色，故得名。按照原料和制作工艺的不同，可分为紧压茶、花卷和散装茶3类。紧压茶主要有茯砖茶、青砖茶、六堡茶等；散装茶有黑毛茶、普洱茶等；花卷主要是千两茶等。

黑茶发酵与微生物存在密切的联系，快速检测发酵过程中微生物的数量和结构，对于茶叶品质的提升以及安全性的评估至关重要。一方面，渥堆处理是黑茶品质形成的关键步骤，其实质是茶原料在一系列微生物的作用下，经过酶促反应和发酵过程，形成叶色黑润、香气纯正的品质特征过程。酵母菌、霉菌和细菌是黑茶发酵过程中的主要微生物群落。另一方面，发酵茶中严格限制各种真菌毒素的检出，所以发酵过程中各种有可能存在的有害微生物的检测也非常必要。

现有茶样品中的微生物检测手段仅见菌落培养法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)相关报道。培养法是指根据每一种微生物的特性及其所需要的营养环境，来进行增菌，生化鉴定和分离培养等。通过选择合适的培养基，可以对菌落总数、大肠菌群、部分霉菌和致病菌等进行检测；但是此方法存在培养周期长、检出率低等问题，无法检测到丰度极低和不可培养的微生物。DGGE分析是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。应用这种特性可以分离微生物的特异性分子标记，比如细菌的16s rDNA、真菌的18s rDNA等；但此方法存在灵敏度和准确性不好的问题，无法检测到丰度极低的微生物，也难以区分序列一致性很高的不同菌种。

酶联荧光原位杂交是一种灵敏度高、荧光背景低、高效快速、对样品前处理要求低的方法。该方法通过在寡核苷酸探针长标记辣根过氧化物酶HRP，使大量的荧光标记的酪胺沉淀至特异性结合了DNA的探针周围，从而在不影响检测特异性的前提下，大幅度提高荧光信号强度，使检测灵敏度大幅度提高。因此，该方法非常适用于茶叶发酵过程这样的复杂环境中微生物的快速检测，且此应用报到较少，未见相关专利申请。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其包括如下步骤：

(1)将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶样品；

(2)将固定后的黑茶样品进行分散处理、过滤，加入琼脂糖保护，封膜后得到第一滤膜；

(3)杂交缓冲液和合成HRP的寡核苷酸探针以300:1混合，得到第一混合液，将第一混合液和第一滤膜混合后孵育，离心后得到第二滤膜；

(4)酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将第二混合液和第二滤膜混合进行信号放大，冲洗后制成玻片标本。

(5)使用荧光显微镜检测、拍照并统计，计算得到黑茶中微生物的数量。