[发明专利]柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品

权利要求书

1.一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将与SEQ ID NO:1有90％以上同源性的基因片段克隆在T载体质粒上所构建得到的重组质粒。

2.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述基因片段是SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述T载体是pTA2载体。

4.一种制备如权利要求1所述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的方法，其包括如下步骤：

1)用柯萨奇B3病毒CVB3感染动物细胞，培养CVB3病毒株；

2)提取细胞总RNA，并通过逆转录合成cDNA；

3)针对柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列，设计合成特异性引物；

4)以步骤2)中得到的cDNA为模板，用步骤3)中得到的特异性引物进行PCR扩增，克隆得到CVB3 VP1保守区序列基因片段；

5)将步骤4)中得到的CVB3 VP1保守区序列基因片段连接到T载体上，构建得到CVB3VP1重组质粒；

6)将步骤5)中得到的CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌感受态细胞中，并对转化子进行培养增殖；

7)从培养后的重组大肠杆菌细胞中提取质粒，对重组质粒进行酶切、测序验证正确，得到作为柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的目标CVB3 VP1重组质粒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是Vero细胞。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述特异性引物包括正向引物SEQID NO:2，和反向引物SEQ ID NO:3，

5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’(SEQ ID NO:2)；

5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤5)中通过热激法、电转导或者化学转导法将CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌中。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是DH5α。

9.如权利要求1至3中任一项所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品在建立柯萨奇B组病毒载量标准曲线中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述标准曲线用作人/动物外周血及组织样品中柯萨奇B组病毒载量的对比曲线。