[发明专利]柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品在审
申请号: | 201911010550.0 | 申请日: | 2019-10-23 |
公开(公告)号: | CN110592287A | 公开(公告)日: | 2019-12-20 |
发明(设计)人: | 陈瑞珍;虞勇;虞莹;王兴冈;邹云增;葛均波 | 申请(专利权)人: | 复旦大学附属中山医院 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 31280 上海申浩律师事务所 | 代理人: | 贾师英 |
地址: | 200032 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 实时荧光定量PCR 重组质粒 标准品 心肌炎 病毒载量 扩增效率 生物样品 线性关系 诊疗 绘制 病毒 参考 | ||
1.一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品,其为通过将与SEQ ID NO:1有90%以上同源性的基因片段克隆在T载体质粒上所构建得到的重组质粒。
2.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品,其特征在于,所述基因片段是SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品,其特征在于,所述T载体是pTA2载体。
4.一种制备如权利要求1所述柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的方法,其包括如下步骤:
1)用柯萨奇B3病毒CVB3感染动物细胞,培养CVB3病毒株;
2)提取细胞总RNA,并通过逆转录合成cDNA;
3)针对柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列,设计合成特异性引物;
4)以步骤2)中得到的cDNA为模板,用步骤3)中得到的特异性引物进行PCR扩增,克隆得到CVB3 VP1保守区序列基因片段;
5)将步骤4)中得到的CVB3 VP1保守区序列基因片段连接到T载体上,构建得到CVB3VP1重组质粒;
6)将步骤5)中得到的CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌感受态细胞中,并对转化子进行培养增殖;
7)从培养后的重组大肠杆菌细胞中提取质粒,对重组质粒进行酶切、测序验证正确,得到作为柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品的目标CVB3 VP1重组质粒。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述动物细胞是Vero细胞。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤3)中所述特异性引物包括正向引物SEQID NO:2,和反向引物SEQ ID NO:3,
5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’(SEQ ID NO:2);
5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)。
7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤5)中通过热激法、电转导或者化学转导法将CVB3 VP1重组质粒导入到大肠杆菌中。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述大肠杆菌是DH5α。
9.如权利要求1至3中任一项所述的柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品在建立柯萨奇B组病毒载量标准曲线中的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述标准曲线用作人/动物外周血及组织样品中柯萨奇B组病毒载量的对比曲线。
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