[发明专利]柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品

说明书

本发明公开了一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将SEQ ID NO:1连接在T载体上得到的重组质粒。该重组质粒具有较高的稳定性和重复性，作为标准品绘制的RT PCR标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系，通过实时荧光定量PCR方法可以对生物样品中柯萨奇B组病毒载量进行绝对值定量，为心肌炎的诊疗工作提供参考。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说，涉及一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品、其制备方法及其应用。

背景技术

国内自1993年起运用RT PCR方法检测人外周血中肠道病毒核酸(李延文，杨英珍，韩琴琴，等。上海医科大学学报，1993,20(6):472)，并将其用于临床常规检测中，为临床诊疗工作提供了有力的支持。但是，常规RT PCR检测方法只能进行定性检测，即针对肠道病毒基因组序列5’端非编码保守区设计引物，通过样本RNA提取、逆转录、PCR扩增、凝胶电泳等步骤对样本进行检测，但该方法的缺点是，无法动态连续反映样本中病毒拷贝数量，对于患者体内病毒载量变化及抗病毒药物疗效评估均无法作出精准评判；其次，以往PCR扩增引物针对肠道病毒基因组序列5’端非编码保守区设计，检测的阳性范围涵盖肠道病毒，包括柯萨奇A组病毒、柯萨奇B组病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒等，目前普遍认为柯萨奇B组病毒3型(CVB3)是致心肌炎的最主要病毒(杨英珍，金佩英，郭棋，等。中华传染病杂志，1989,7(1):4-7。Hingorani AD.Post infections myocarditis.BMJ,1992,304:1676-1678。RemesJ,Helin M,Vaino P,et al.Clinical outcome and left ventricular function 23years after acute coxsackie virus myopericarditis.Eur Heart J,1990,11:182-188)。因此，原先临床检测人外周血中肠道病毒核酸的RT PCR方法对临床诊疗工作的帮助存在局限性。

近几年来，采用实时荧光定量PCR对病毒进行检测的技术快速发展，但是其在柯萨奇B组病毒3型(CVB3)的定量检测方面存在一个掣肘的缺陷，就是目前市场上缺少一种能够通过廉价方法大量获得、质量稳定、准确反映病毒CVB3存在及数量的标准对照样品。

发明内容

为了促进实时荧光定量PCR检测柯萨奇B组病毒技术的推广应用，以低生产成本大量提供稳定性高、可重复性好的CVB3标准品或称CVB3检测参照品，发明人对于柯萨奇B组病毒的结构和组成进行了研究，发现其全长基因组中某些区域具有高度保守性(即稳定性)和特征代表性(或称特异性)，这一发现构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括以下技术方案。

一种柯萨奇B组病毒实时荧光定量PCR标准品，其为通过将与SEQ ID NO:1有90％以上、优选95％以上、更优选98％、更优选99％以上同源性的基因片段克隆连接在T载体质粒上所构建得到的重组质粒。其中，SEQ ID NO:1的碱基序列为：

CGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACTCCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCATGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCCAGTAACACCATAGAGGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGACCAGGCCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTG(SEQ ID NO:1)。

上述基因片段优选是SEQ ID NO:1。

优选地，上述T载体可以是pTA2载体质粒。