[发明专利]人纤维蛋白体外降解方法

说明书

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及人纤维蛋白体外降解方法。本发明对纤维蛋白采用过滤研磨的方式进行前处理，将制备的纤维蛋白在机械剪切力的作用下形成均一，细小的颗粒状，方便后续纤溶酶的降解。并且通过控制加入纤溶酶的量，以及在纤溶结束后，迅速离心获得上清后，通过添加一定量的冻干配方，制成冻干品可以长期稳定保存1年以上。另外经实验证实，本发明方案中的参数下能够获得更稳定的降解产物，相对于其他参数具有更明显的优势。

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及人纤维蛋白体外降解方法。

背景技术

纤维蛋白溶解系统简称纤溶系统，是指纤溶酶原在纤溶酶作用下转变为纤溶酶。纤溶系统主要包括纤溶激活物，抑制物和纤溶蛋白构成。在体内纤溶系统的激活主要包括三条途径，即内激活途径，外激活途径和外源激活途径，内激活主要由内源凝血系统的有关因子启动，因子XIIa，XIa，高分子量激肽原HMWK，激肽释放酶参与，是继发性纤溶的理论基础；外激活主要是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激型纤溶酶原激活物(u-PA)作用的，同时二者又受纤溶酶原激活物抑制物(PAI)的抑制，构成原发性纤溶的理论基础。外源激活途径是指向体内注入纤溶激活物链激酶(SK)，尿激酶(UK)，重组t-PA等实现栓溶的目的，是栓溶治疗的理论基础。

纤维蛋白作为凝血瀑布启动后产生的止血血块，机体形成后会激活纤溶系统所产生的纤溶酶对其进行降解从而达到溶栓的过程。D-二聚体和纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定试剂盒可以对纤维蛋白或者纤维蛋白原降解产物进行测定。

FDP和D-二聚体检测在临床应用上非常广泛，对于VTE的阴性排除，DIC的辅助诊断，恶性肿瘤，白血病以及各类原发性和继发性纤溶亢进的诊断，栓溶后的药物实验室检测都可以通过FDP和D-二聚体的指标来判断。

而现有技术中，大多分别制备FDP和D-二聚体来制备试剂盒，这种方法比较复杂。而少量的关于同时制备FDP和D-二聚体，并用于检测，但所得的FDP和D-二聚体纯度和稳定性都存在一定的问题，无法作为质控品或标准品。

纤溶酶作用于纤维蛋白原后的早期分解产物为X片段，随后X片段进一步降解为Y片段和D片段，Y片段进一步降解为E片段和D片段，最终纤维蛋白原在纤溶酶的作用降解为E片段和D片段。纤溶酶作用于交联的纤维蛋白时，最终产物包含了D-二聚体，XDP，D片段和E片段等混合物，其中D-二聚体由两个D片段和一个E片段构成，XDP是高分子片段由多聚体构成。

纤维蛋白(原)降解产物检测，主要是针对发生纤溶后的一些列产物进行测定，主要包括D-二聚体，XDP，X，Y等片段。通过乳胶免疫比浊法测定，在乳胶颗粒上包被好可以检测相应的FDP和D-二聚体的单克隆抗体，利用抗原抗体结合后阻挡光路，通过检测光浊度的变化，和预先设好的定标曲线来定量检测FDP和D二聚体的含量。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人纤维蛋白体外降解方法。该方法获得的D-二聚体和FDP品质优良，能够作为质控品和校准品，也可以作为抗原免疫或筛选相应的抗体。

本发明提供了人纤维蛋白体外降解方法，包括：

将人纤维蛋白以Tris缓冲液重悬，搅拌10～20min后，弃除液体进行研磨；

所述研磨的产物以Tris降解缓冲液重悬，加入纤溶酶，37℃，100rpm摇床酶解；

所述酶解的产物经4000rpm离心30min取上清，与2×冻干缓冲液混合，进行赋值后冻干，制得人纤维蛋白降解产物；

所述Tris降解缓冲液包括：50mM Tris-HCl，0.9％的NaCl，0.1％苯甲酸钠，pH值为8.5；

所述2×冻干缓冲液包括：Hepes 4wt％、海藻糖1g/L、牛白蛋白70g/L、甘露醇40g/L、苯甲酸钠0.2wt％，pH值为7.6～7.8；