[发明专利]一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE和西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，宿主菌为大肠杆菌；所述西柏三烯一醇合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述西柏三烯一醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录号为No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录号为No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank登录号为No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank登录号为NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank登录号为NO.X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GenBank登录号为NO.NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，GenBank登录号为NO.NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE,GenBank登录号为No.M87280.1。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)克隆烟草西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE连接到中间载体I上，得到重组质粒I；将西柏三烯一醇合成醇基因CBTS2a，克隆到中间载体II载体上得到重组质粒II；所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录号为No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录号为No.AAG02439；所述法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，GenBank登录号为NO.NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE,GenBank登录号为No.M87280.1；

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒、步骤(2)所得重组质粒I与重组质粒II转化E.coli感受态细胞，得到用于生产西柏三烯一醇的工程菌；所述pYJM14质粒携带有来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GenBank No.NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19，GenBank NO.X97557.1和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GenBankNO.NM_001183931.1。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述中间载体I为pACYC-Duet-1；所述中间载体II为pET28a(+)载体。

4.权利要求1所述的基因工程菌在生产西柏三烯一醇中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是指将获得的基因工程菌株经发酵培养基培养后，加入IPTG诱导，继续培养后所得培养液依次经萃取、蒸馏得到西柏三烯一醇。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为37℃，180rpm，培养至OD 600 为0.4-0.6，加入IPTG，然后在30℃，180rpm培养24-48小时。

7.根据权利要求5所述的应用，所述萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯；所述蒸馏为减压蒸馏。