[发明专利]一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程学领域。为了实现高产、高效率、低成本合成西柏三烯一醇，本发明将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烟草西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a与表达载体连接，然后转化到含用MVA途径及GGPP高能量合成途径的工程菌中，得到生产西柏三烯一醇的基因工程菌。本发明的基因工程菌经过发酵培养46小时，西柏三烯一醇的产量可高达500mg/L。本发明的基因工程菌可以直接从菌体中获得高产量、高纯度的西柏三烯一醇，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程学领域，具体涉及一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

西柏三烯一醇是由烟草叶面腺毛分泌的西柏烷类化合物。在烟叶烘烤调制和陈化过程中，西柏类化合物降解产生茄酮及衍生物等香味成分，是影响烟叶品质的重要成分。此外西柏三烯一醇对抵抗昆虫的侵袭具有良好的抗性，而且具备易于生物降解等特性，近年来作为生态友好且可快速生物降解的杀虫剂代表越来越受到人们的关注。同时，西柏三烯一醇也可以作为一些抗肿瘤、抗生素以及神经保护药物的前体物质。由于植物中含量较低，且存在较多官能化衍生物，大规模纯化生产西柏三烯一醇的技术难度较大，且成本高、效率低、对环境有较大污染。利用微生物合成法生产西柏三烯一醇，具有成本低、产量高、工艺简单、易于放大等优点，并且不受季节、气候条件的限制。模式微生物大肠杆菌，具有生长速度快，遗传背景清楚，易于分子操作等特点，是理想的宿主。

在烟草中，萜类代谢前体物IPP与DMAPP是由甲羟戊酸(MVA)代谢途径和丙酮酸/3-磷酸甘油醛代谢(MEP)合成。IPP与DMAPP在牻牛儿基焦磷酸缩合成GPP，然后再与2个IPP在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的作用下缩合成牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。GGPP在西柏三烯一醇合成酶CBTS的作用下环化形成西柏三烯一醇。在大肠杆菌内，IPP与DMAPP是通过MEP代谢途径合成，在法尼烯焦磷酸合成酶(FPPS)的作用下，DMAPP与2个IPP缩合形成C15骨架FPP，本身并不能合成GGPP，需要引入外源牻牛儿基焦磷酸合成酶(CrtE)催化形成GGPP。同时，大肠杆菌本身MEP途径通量较低，近年来，大部分文献报道，通过需要引入异源MVA途径加强IPP与DMAPP的供应，极大的提高了萜类化合物的产量。Wolfgang Mischko等通过引入CBTs，同时过表达MEP途径中DXS与IDI两个酶，构建了一株可以生产西柏三烯一醇的菌株，最终在50L的发酵罐中发酵120h，产量达到78.9mg/L(Wolfgang Mischko,et al.Modularbiomanufacturing for a sustainable production of terpenoid-based insectdeterrents.Green Chemistry.2018,20,5374)。但是该工程菌仍然存在发酵周期长，产物产量低等问题。

发明内容

为了实现高产、高效率、低成本合成西柏三烯一醇，本发明提供了一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌，所述基因工程菌表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI、法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE和西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a，宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述西柏三烯一醇合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地限定，所述西柏三烯一醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。