[发明专利]基于nanoBRET的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法

说明书

本发明公开了基于nanoBRET的促蛋白泛素化降解药物筛选系统及方法。筛选系统包括：荧光蛋白修饰的泛素表达质粒，用于表达荧光蛋白修饰的泛素；内源性泛素基因UBB及UBC敲除的细胞系；以及靶蛋白‑荧光素酶融合蛋白。本发明的一些实例，避免了每次检测前18小时加入小分子荧光底物，同时也避免了小分子荧光底物对细胞造成的毒性影响，使用方便，可以实时监测活细胞中靶蛋白的泛素化水平，结果更加可靠，可以直观反映待筛选化合物对靶蛋白的影响，利于促蛋白泛素化降解药物的高通量筛选。

技术领域

本发明涉及一种药物筛选系统及方法。

背景技术

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。该系统包括由泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugatingenzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitin protein ligase,E3)、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成。其中：

①泛素：含有76个氨基酸残基，分子量约8.5kDa，广泛存在于真核细胞。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。另外，泛素化在蛋白的内吞和外泌作用中有目标定位功能。

泛素分子全长包含7个赖氨酸位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)和1个位于C端的甘氨酸(Gly)位点以及位于N端的甲硫氨酸(Met1)位点。根据现有研究,无论在细胞内环境还是胞外反应体系,泛素自身的每个赖氨酸位点以及N端的甲硫氨酸(Met1)位点都可以发生泛素化从而延伸泛素链。其中对K48和K63位多聚泛素化的研究最广泛,而其他类型的泛素化链研究较少且被认为是非典型泛素化。但是随着对泛素化链的装配、识别以及水解的深入研究,非典型泛素化的功能与意义也逐渐得到了重视。

②泛素活化酶E1：通过半胱氨酸残基与泛素C端活化的甘氨酸残基形成硫酯键，E1-泛素中间体中的泛素可以转移给数个E2。

③泛素结合酶E2：以泛素结合酶方式起作用，活性部位为半胱氨酸，部分E2成员在细胞特定过程中发挥作用，但E2的全部作用尚不清楚。

④泛素连接酶E3：为泛素-蛋白酶体系统选择性降解机制的关键因素，识别被降解的蛋白并将泛素连接到底物上。

⑤蛋白酶体(2.5MDa)：由2个19S和1个20S亚单位组成的桶状结构，19S为调节亚单位，位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。19S亚单位上还具有一种去泛素化的同功肽酶，使底物去泛素化。20S为催化亚单位，位于两个19S亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。

泛素-蛋白酶体系统降解蛋白是一个多步骤反应过程，有多种不同蛋白质参与。需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接。这一过程是一个三酶级联反应，即需要有由三个酶催化的一系列反应的发生，整个过程被称为泛素化信号通路。在第一步反应中，泛素活化酶(又被称为E1)水解ATP并将一个泛素分子腺苷酸化。接着，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。被腺苷酸化的泛素分子接着被转移到第二个酶，泛素交联酶(E2)的半胱氨酸残基上。最后，高度保守的泛素连接酶(E3)家族中的一员(根据底物蛋白质的不同而不同)识别特定的需要被泛素化的靶蛋白，并催化泛素分子从E2上转移到靶蛋白上。靶蛋白在被蛋白酶体识别之前，必须被标记上至少四个泛素单体分子(以多泛素链的形式)。因此，是E3使得这一系统具有了底物特异性。E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细胞类型，人体中就存在大量不同的E3蛋白，这说明泛素-蛋白酶体系统可以作用于数量巨大的靶蛋白。泛素受体蛋白的N末端具有一个类泛素结构域，以及一至多个泛素结合结构域。类泛素结构域可以被19S调节颗粒所识别，而泛素结合结构域可以通过形成三螺旋束来结合泛素。这些受体蛋白可能能够结合多泛素化的蛋白质并将其携带到蛋白酶体降解。