[发明专利]一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用在审
| 申请号： | 201911015991.X | 申请日： | 2019-10-24 |
| 公开（公告）号： | CN110734926A | 公开（公告）日： | 2020-01-31 |
| 发明（设计）人： | 王洪成;沙冲;邵蔚蓝 | 申请（专利权）人： | 江苏大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/56;C12N9/42;C12N1/21;A23K20/189;C12R1/19 |
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| 地址： | 212013 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 内切葡聚糖酶 大肠杆菌 蛋白 表达载体 生物工程领域 原核宿主细胞 生物安全性 高温灭活 高效表达 热纤梭菌 生物发酵 外来蛋白 载体构建 表达量 酶活性 缺陷型 构建 抗生素 发酵 筛选 基因 转化 应用 保证 生产 | ||
1.一种内切葡聚糖酶表达载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶表达载体，其特征在于，所述表达载体的筛选基因为大肠杆菌glmS基因，原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌；内切纤维素酶celD基因插入到筛选基因与pHsH-Amp载体片段连接后的pHsh-GlmS质粒载体中，转化至原核宿主细胞后得到内切葡聚糖酶表达载体。
3.权利要求1所述的内切葡聚糖酶表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以大肠杆菌为模板扩增glmS基因cDNA片段，以pHsH-Amp为模板扩增得到pHsh载体片段，将磷酸化的glmS基因cDNA片段与pHsh载体片段平端连接后转化至gfa缺失型大肠杆菌中，筛选得到pHsh-GlmS质粒；
（2）以C.thermocellum基因组为模板扩增celD基因片段，将celD基因片段插入到步骤（1）中得到的pHsh-GlmS质粒，平端连接后转化至大肠杆菌E. coliΔglmS中，挑取转化子，测序后得到表达载体pHsh-GcelD。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述扩增glmS基因cDNA片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示，扩增pHsh载体片段引物的核苷酸序列如SEQID No.3和4所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述平端连接时glmS基因cDNA片段与pHsh载体片段的摩尔比为3：1。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述扩增celD基因片段引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5和6所示，扩增pHsh-GlmS载体片段引物的核苷酸序列如SEQID No.7和8所示。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，将celD基因片段插入到pHsh-GlmS质粒的Hsh启动子表达框中。
8.一种包含有权利要求1所述的内切葡聚糖酶表达载体的重组菌。
9.权利要求1所述的内切葡聚糖酶表达载体在发酵制备饲料和/或饲料添加剂中的应用。
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