[发明专利]一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及生物工程领域，具体涉一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。本发明提供一种内切葡聚糖酶表达载体，其筛选基因为大肠杆菌glmS基因，原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌，转化E.coliΔglmS后生产的蛋白只有大肠杆菌自身蛋白和内切葡聚糖酶蛋白而不含有抗生素等其它外来蛋白，具有相对的安全性；经过发酵和高温灭活处理，既可以消除大肠杆菌的毒性，又可以保证本酶活性的存在；使得来源于热纤梭菌（C.thermocellum ATCC 27405）的CelD基因实现生物安全性高效表达。本发明所提供的载体构建方法简单，安全性好，成本低，具有较高的表达量，可为饲用内切葡聚糖酶的生物发酵提供批量、低价、高质量的原材料。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

内切葡聚糖酶（CelD）和纤维二糖酶（CelS）作为热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）纤维小体中酶活性最高的内切纤维素酶和外切纤维素酶组分，常作为饲料酶使用，目前，饲料酶的工业化生产主要采用真核细胞发酵方法，但是真核发酵生产往往没有原核生物细胞生产的成本低，由于原核生物如大肠杆菌的自身毒素和表达载体中含有抗药基因的问题，利用原核细胞工业化生产饲料酶一直未实现。

分子生物学技术的发展使得利用宿主细胞表达并大规模生产重组蛋白成为可能，利用基因表达方法构建表达载体实现饲料酶的原核细胞的安全性表达成了热点问题。但是，在利用原核生物细胞表达目标蛋白时，主要采用抗生素或者营养缺陷型筛选标记来生产目标蛋白，抗生素存在抗药性问题，而营养缺陷型筛选标记容易发生回复突变。

谷氨酰胺:6-磷酸果糖氨基转移酶(Gfa)又称6-磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm)，它是一种胞内酶，催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸，即氨基已糖合成代谢途径中的第一步反应。Gfa几乎存在于每个物种和组织中，是生命活动所必需的。尚未发现有以大肠杆菌自身的glmS 基因作为筛选标记实现饲料酶-内切葡聚糖酶的原核细胞工业化生产相关的研究与报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内切葡聚糖酶表达载体及其构建方法与应用。本发明对来源于热纤梭菌的内切葡聚糖酶进行原核表达，表达载体由无抗生素标记的生物安全性glmS基因作为筛选基因，转化至glmS缺失菌株E.coliΔglmS后生产内切纤维素酶，由于内切纤维素的热稳定性，加热处理消除大肠杆菌自身蛋白的毒性，并且保留目标蛋白的活性来实现饲料酶的原核细胞的生物安全性表达。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

在一些实施方案中，本发明提供了一种内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。所述表达载体pHsh-GcelD的筛选基因为大肠杆菌glmS基因，原核宿主细胞为glmS基因缺陷型大肠杆菌。大肠杆菌glmS基因与pHsH-Amp载体片段连接后获得pHsh-GlmS质粒载体，将内切纤维素酶celD基因插入到pHsh-GlmS质粒载体后转化至glmS基因缺陷型大肠杆菌后提取。

在一些实施方案中，本发明提供了上述内切葡聚糖酶表达载体pHsh-GcelD的构建方法，具体包括以下步骤：

（1）以大肠杆菌为模板扩增glmS基因cDNA片段，以pHsH-Amp为模板扩增得到pHsh载体片段，将磷酸化的glmS基因cDNA片段与pHsh载体片段平端连接后转化至gfa缺失型大肠杆菌中，筛选得到pHsh-GlmS质粒；

（2）以C.thermocellum基因组为模板扩增celD基因片段，将celD基因片段插入到步骤（1）中得到的pHsh-GlmS质粒，平端连接后转化至大肠杆菌E. coliΔglmS中，挑取转化子，测序后得到表达载体pHsh-GcelD。