[发明专利]一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽

说明书

本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽，提供了一种新型抗菌机制，即通过关闭宿主肠细胞的感染反应信号来保护肠细胞免受肠致病菌大肠杆菌的侵害。该活性肽(VPPPVPPRRX‑GSGK‑Cyclo(FfΦRrRrC))与Nck‑SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断了衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止了EPEC感染Caco‑2细胞。EPEC给药前口服此活性肽可保护小鼠肠细胞免受EPEC感染，并保护动物免受EPEC引起的腹泻。同时根据MTT法，该肽对Caco‑2细胞本身的细胞毒性小，生物安全性高。

技术领域

本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽。

背景技术

1929年青霉素的发现开启了人类历史上抗菌运动的新纪元，人类第一次拥有自己的武器来抵御由细菌引起的恶意感染。自那以后，科学家们发现并发明了许多能够治疗或预防细菌感染的药物和治疗方法，包括杀菌剂、抑菌剂和疫苗。然而，长期大量使用抗生素已经引发了一系列的抗药性问题，再次开始危害人类健康。随着全球耐药性的增加，抗菌药物的开发受到了阻挠，特别是近年来缺乏新的机制或目标。因此，需要开发与上述机制显著不同的新机制来应对这场耐药危机。

大肠杆菌引起的腹泻是所有国家和地区的流行病或潜在流行病。更具体地说，肠道致病菌大肠杆菌(EPEC)引起水样腹泻，伴有发热和呕吐，主要是2岁以下儿童。目前，临床上治疗EPEC感染主要是抗生素，但随着头孢他啶、氨基糖苷类、喹诺酮类等β-内酰胺类抗生素耐药性的出现，多药耐药肠杆菌科对腹腔感染的控制是一个尚未解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种可特异性阻断衔接蛋白Nck的结合位点用于预防肠道EPEC感染的活性肽。

EPEC感染的标志是肠粘膜上形成附着和缺失(A/E)损伤，表现为微绒毛破坏。EPEC感染的机制包括三个主要步骤：1.细菌附着在肠细胞表面；2.细菌向肠细胞注射蛋白质Tir；3.肌动蛋白基座在肠细胞上形成附着和缺失损伤，腹泻开始。Nck在宿主细胞中充当细菌蛋白Tir与Arp2/3复合依赖性肌动蛋白聚合途径之间的衔接体。Nck蛋白(包含四个串联的结构域，一个SH2结构域和三个SH3结构域。已知Nck1-SH3.2对于吸收WIP/WASP复合物是必需的，敲除Nck-SH3.2结构域，可消除EPEC感染后肌动蛋白的重组。因此本发明设想一种阻断NCK-SH3.2结构域蛋白结合位点的肽将抑制EPEC介导的基座形成，进而阻断EPEC进入机制，保护细胞免受EPEC的感染。

本发明将Cyclo(FfΦRrRrC)细胞穿透肽，与肽序列VPPPVPPRRX(简称P1)结合后，形成的活性肽(VPPPVPPRRX-GSGK(是Gly-Ser-Gly-Lys(Alloc)多肽链，起连接作用)-Cyclo(FfΦRrRrC))(简称P6)能够有效进入Caco-2细胞，与Nck-SH3.2结构域的半胱氨酸共价反应，阻断衔接蛋白Nck的结合位点，并阻止EPEC感染Caco-2细胞并能预防肠道EPEC导致的腹泻，这种保护持续时间长。且该活性肽对Caco-2细胞本身的细胞毒性小，生物安全性高，具有广泛的应用前景。

本发明的具体技术方案如下所述：

将Cyclo(FfΦRrRrC)与P1结合，形成的活性肽P6能够有效进入Caco-2细胞。其中，Cyclo(FfΦRrRrC)为细胞穿透肽，Cyclo(FfΦRrRrC)中，Φ：3-(1-Naphthyl)-L-alanine；r：D-Arg；f：D-Phe，与P1结合后能够有效进入Caco-2细胞，主要分布在细胞质中，破坏了细胞中硫醇分子的存在；肽序列VPPPVPPRRX(P1)中的X是一种非天然氨基酸，具体为二氨基丙酸，(2S)-2-氨基-3-[(α-氯乙酰基)氨基]-丙酸，在其侧链上含有亲电α-氯乙酰基。