[发明专利]一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法

说明书

本发明提供一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，这种RGD环肽具有的特征为含有2个以上的半胱氨酸，‑RGD‑序列，以及在此基础上的各种修饰肽。溶解的步骤包括将多肽溶于水和乙腈混合溶剂得到多肽溶液，并在其中加入少量还原性试剂；反相色谱柱分析的步骤包括将RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱；反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括根据分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度以及将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集的步骤,的制备流动相需经过脱气及充氮气处理。纯化过程中解决了此类RGD多肽纯化过程中容易氧化以及氧化后形成同分异构体的问题，能够得到纯度大于98％的产品。

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及含有多个半胱氨酸易氧化的-RGD-多肽的纯化方法。

背景技术

癌症在世界上的发病率近年来呈急剧上升的趋势。研究发现肿瘤在生长过程中依赖于血管的生成，含有RGD序列的小肽即是穿膜肽，可以穿越细胞膜，又可以起到抑制血管生成的作用，从而抑制肿瘤细胞血管的形成、生长以及转移。因此，RGD多肽在癌症治疗中具有重大作用，有很大的市场价值。目前含有RGD序列的多肽研究越来越成熟，出现了一些RGD多肽的衍生多肽，例如在RGD多肽上偶联紫杉醇、金刚烷甲酸、吉西他滨等，还有一类为iRGD相似的序列，含有2个以上的半胱氨酸。

含有多个半胱氨酸的RGD多肽纯化比较困难，是由于多肽本身的性质决定的，在纯化过程中非常容易氧化。目前对这类多肽的制备方法报道很少，一般采用反相制备的方法纯化得到成品，但该方法无可避免的会导致在纯化过程中多肽已经氧化。而且，具有一对二硫键、多个半胱氨酸的RGD多肽在纯化时，会由于含有裸露的巯基而发生副反应而形成同分异构体。发生氧化后后续的还原过程比较繁琐，成本消耗较高。有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种RGD多肽的纯化方法，能够降低氧化的风险，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种克服现有生产工艺的不足、解决了含有多个巯基RGD多肽在纯化过程中容易氧化的问题的RGD序列多肽的纯化方法。

根据本发明的一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，该方法包括多肽的溶解、反相色谱柱分析和反相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述溶解的步骤包括将RGD肽溶于溶剂中得到多肽溶液。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相色谱柱分析的步骤包括将上述RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。

当作为反相色谱柱分析的梯度检测时，溶解后得到的多肽溶液过滤后进行粗品分析检测。

当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，溶解后得到的多肽溶液用水稀释到合适的比例，进行进样吸附并洗脱收集。

当作为反相制备色谱柱吸附及洗脱收集时，洗脱多肽的溶液应进行脱除氧气，并充氮气处理。

根据本发明的另一方面提供了一种含有多个半胱氨酸的RGD肽的纯化方法，上述反相制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：

(1)根据分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度；

(2)将RGD多肽溶液接制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。

进一步的，反相色谱柱分析的步骤包括将RGD多肽溶液接反相色谱分析柱进行梯度检测，得到分析图谱。

反相梯度检测分析条件为：

流动相：A液：0.05％～0.2％三氟乙酸的水溶液；B液：乙腈；

分析柱：Kromasil 100-5C18-MS 5um 4.6*250mm；