[发明专利]一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法

说明书

本发明公开了一种利用淀粉生产甲萘醌‑7的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过温度诱导适应性进化，诱导最适温度为50℃的芽孢杆菌，以50g/L可溶性淀粉为唯一碳源时，50℃下摇瓶培养6d后MK‑7产量达到37.1±2.1mg/L，MK‑7合成效率大大提高，将有利于提高淀粉的利用率和降低MK‑7生产成本。

技术领域

本发明涉及一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

自然界中的维生素K主要有两种类型，第一种是维生素K1，也称为叶绿醌，主要来自于植物；第二种是维生素K2，也称为甲萘醌，主要由微生物代谢产生，最初是从纳豆中分离得到。纯品维生素K2为黄色粉末，其结构是由一个甲基萘醌母环和一条位于母环C-3位置上的异戊二烯侧链组成，根据侧链上异戊二烯单元个数差异，维生素K2共分为14种，以MK-n表示，甲萘醌-7(MK-7)即表示侧链上含有7个异戊二烯单元的维生素K2。MK-7具有多种生理功能，例如作为哺乳动物中凝血因子II、VII、IX和X的一个重要的辅因子，参与血液凝固；抑制成骨细胞的生长并刺激成骨细胞的分化，形成骨头；提高骨头中的矿物质密度，降低髋骨骨折风险；提高骨钙蛋白的羧化作用；降低血压；促进以神经生长因子为媒介的PC 12D细胞的轴突生长；通过调控Ca²⁺的利用和促进Gla蛋白质的活性，防止钙质在血管中沉淀而造成的动脉硬化等。因此MK-7作为新一代的保健食品，其功能正在受到越来越多的关注。

前人研究发现，采用微生物发酵法将是未来工业化生产MK-7的唯一方法。虽然多种微生物可以用于合成MK-7，但是芽孢杆菌属的微生物更具有生产MK-7的潜力。目前，研究人员已从多个方面来试图提高利用微生物发酵生产MK-7，具体包括：(1)优化培养方式；(2)优化培养基组成和培养条件；(3)改善发酵反应器；(4)将合成菌株固定在纳米材料上；(5)采用传统诱变方法解除合成途径中反馈作用；(6)采用基因工程手段强化合成途径中碳通量。虽然上述方法取得利率一定的成果，但是目前用于发酵生产MK-7的碳源全都是甘油。以甘油为唯一碳源生产MK-7存在许多问题，如抑制多聚物的合成和增加了发酵液的渗透压，从而影响菌体对底物的利用和产物的胞外运输。

众所周知，芽孢杆菌属的微生物可以利用单糖、双糖和多糖作为碳源用于菌体生长和合成某些代谢产物。目前，有报道采用葡萄糖、蔗糖、甘露醇甚至是可再生的农业原料如淀粉、玉米粉水解液和豆腐渣来生产MK-7。淀粉是高分子碳水化合物，是由葡萄糖分子经α-1,4糖苷键连接而成。需要指出的是，虽然淀粉可以用于发酵生产MK-7，但是其产量比较低，无法实现工业化应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种高效利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，通过温度诱导适应性进化，诱导最适温度为50℃的芽孢杆菌，以50g/L可溶性淀粉为唯一碳源时，50℃下摇瓶培养6d后MK-7产量达到37.1±2.1mg/L，MK-7合成效率大大提高，将有利于提高淀粉的利用率和降低MK-7生产成本。

本发明的第一个目的是提供一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，包括如下步骤：

(1)将出发芽孢杆菌接种于种子培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发芽孢杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ₀，即μ＝χ₀；

(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发芽孢杆菌接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃进行培养，测定菌株在40-42℃下的比生长速率μ＝χ₁；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃进行培养，测定菌株在40-42℃下的比生长速率μ＝χ₂；重复上述步骤，直至菌株在40-42℃下比生长速率μ≈χ₀，得到在40-42℃下正常生长的突变菌株；

(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在40-42℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；